豬流行性腹瀉實驗診斷技術的研究進展

葉 麗，湯德元，曾智勇，王 彬，黃 濤，胡玲玲，龍冬梅，石遠菊，楊 偉

（貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

豬流行性腹瀉實驗診斷技術的研究進展

葉 麗，湯德元*，曾智勇，王 彬，黃 濤，胡玲玲，龍冬梅，石遠菊，楊 偉

（貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒引起的一種豬的高度接觸性的腸道傳染病，該病以排水樣稀糞、嘔吐、脫水及哺乳仔豬高死亡率為主要特征，給生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重危害。豬流行性腹瀉于20世紀80年代在我國暴發(fā)并流行至今，該病不僅發(fā)生范圍廣、強度大、致死率高，且常與豬傳染性胃腸炎、豬輪狀病毒及德爾塔冠狀病毒等傳染病混合感染，臨床診斷并不能對該病確診，必須運用一些實驗室方法才能準確診斷該病。通過對豬流行性腹瀉的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、免疫熒光法(IF)、RT-PCR診斷技術、多重PCR技術、實時熒光定量PCR技術、環(huán)介導等溫擴增檢測技術（LAMP）等幾種實驗室檢測技術進行綜述，以期對該病的診斷及確診提供可靠的實驗方法和一定的技術依據(jù)。

豬流行性腹瀉；PCR技術；LAMP技術；ELISA；免疫熒光法；診斷

豬流行性腹瀉(PED) 是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV) 引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，該病是當前生豬養(yǎng)殖中的一種常見的疾病，也是春、冬季節(jié)規(guī)?；i場中導致仔豬死亡的主要原因之一。哺乳仔豬、育肥豬等各年齡段均可發(fā)病，但哺乳仔豬發(fā)病率和死亡率最高。自1978年比利時首先報道分離到該病病毒以來，PED疫情于世界各地相繼暴發(fā)流行[1]，尤其是從2010年開始，PED暴發(fā)更為頻繁，造成大量豬只嚴重腹瀉甚至死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經濟損失[2-4]。

PEDV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，是冠狀病毒科( Coronaviridae) 甲型冠狀病毒屬 ( Alpha-coronavirus) 的成員，其基因組全長約28 kb，包括5`端非編碼區(qū)、3`端非編碼區(qū)以及至少7個開放閱讀框(ORF1a，ORF1b，ORF2～6) ，分別編碼： 纖突蛋白(S)、膜糖蛋白(M) 、核衣殼蛋白(N) 、小包膜蛋白(E) 和ORF3編碼的非結構蛋白[5]。

本文主要從PEDV的酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)、免疫熒光法(IF)、普通RT-PCR 技術、多重PCR技術、實時熒光定量PCR 技術、環(huán)介導等溫擴增檢測（LAMP）技術及病毒分離鑒定等幾種實驗室檢測技術進行綜述，以期對豬流行性腹瀉的確診提供參考的實驗方法。

1 病毒分離鑒定

病毒分離培養(yǎng)鑒定是比較可靠、靈敏、準確的畜禽疾病檢測方法，且即使極少量病毒也可檢出。有研究指出，PED 對胰酶有耐受性，初次分離時不易在PK-15、IBRS、Vero等細胞上增殖。

常規(guī)方法，是將PEDV接種于Vero細胞，若接種后第2天細胞出現(xiàn)細胞病變（CPE）現(xiàn)象，則幾乎可以確診患有PED。由于考慮到某些特殊情況，還是必須結合其他檢測結果，再做出相應的診斷。

2 酶聯(lián)免疫吸附試驗

ELISA是酶免疫檢測方法中使用最廣泛的技術。該方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，再使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行，最后用洗滌法洗去游離成分。

ELISA 檢測法是血清學檢測的最常用方法之一，目前國內學者對PEDV也進行了大量的研究， 建立了有效的ELISA檢測方法。陳茹等[6]使用非洲綠猴腎（Vero）細胞增殖適應傳代細胞培養(yǎng)的PEDV，并經聚乙二醇（PEG）沉淀法分離純化PEDV抗原，建立斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗(Dot-ELISA)來檢測PED抗體。在最適工作條件下，進行了敏感性和特異性試驗，結果顯示，該法檢測PEDV抗體的敏感、特異、重復性好，且方便、快捷，適用于大批量樣品的檢測，可作為一種診斷PED的比較理想的方法。使用該方法對國內外種豬群的血清樣共834份進行了檢測，檢出PEDV抗體陽性率為21%。姜艷平等[7]的研究是用原核表達的重組N蛋白作為檢測抗原，通過優(yōu)化ELISA反應條件，建立新的PEDV間接ELISA檢測方法。該法對PEDV血清樣本檢出陽性，而對被豬傳染性胃腸炎、豬輪狀病毒感染豬的血清檢測結果均為陰性；對批內、批間分別進行重復性試驗，結果表明，變異系數(shù)均小于10%。使用建立的ELISA方法檢測了130份臨床血清樣品，檢出PEDV抗體陽性78份。該研究表明建立的以重組N蛋白為包被抗原檢測PEDV血清抗體的方法可用來檢測是否感染PEDV，也可進行流行病學調查。以原核表達的重組N蛋白作為檢測抗原，經過一系列條件的優(yōu)化，建立了PEDV 間接ELISA抗體檢測方法。

3 免疫熒光檢測

IF分為直接免疫熒光技術（FAT）、間接免疫熒光技術( IFAT)及免疫過氧化物酶技術，3種都是實驗室診斷常用方法。若用該法檢測呈陽性，且有腹瀉癥狀，則差不多可以確診為 PEDV。研究證明，F(xiàn)AT是一種比較可靠的檢測病料中的 PEDV 抗原的診斷方法，目前該檢測方法得到廣泛應用。崔現(xiàn)蘭等[8]采用 FAT 檢測病豬小腸的冷凍切片，檢出PEDV人工感染仔豬率為91.4% 。朱維正等[9]分別采用間接血凝試驗和 IFAT進行試驗比較后，得出 IFAT 法更敏感、高效。林志雄等[10]用可在 Vero、PK15等傳代細胞株生長繁殖的PEDV－G1株建立了FAT法。同時，與哈爾濱獸醫(yī)研究所建立的熒光抗體方法進行比較，結果表明，陽性符合率為95% (19/20)，陰性符合率90%(9/10)。且沒有和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、輪狀病毒、豬細小病毒和大腸桿菌發(fā)生交叉反應。結果表明此方法具有較高的準確性和特異性。

4 RT- PCR檢測

RT-PCR方法具有特異性較強、靈敏度較高、重復性好、操作簡易等優(yōu)點，且只需幾個小時的實驗，便能達到快速檢測的目的，該法為PED提供了一種快速、準確的鑒別診斷方法。該法現(xiàn)被用于PED的凈化診斷和流行病學調查。

國外，在豬病毒性腹瀉方面，Woods、Paton[11]等應用 RT-PCR 技術檢測TGEV，證明了RT-PCR檢測PEDV是一種比較敏感、特異的診斷方法。Kim、Chae[12]等運用RT-PCR方法對韓國的639個豬場進行了PEDV和TGEV的調查，并通過與其他方法的比較得出RT-PCR方法是目前鑒別診斷PEDV和TGEV最特異、敏感的方法，這與 Kdabota等的研究結果相同。Kim等對原位雜交、免疫組化和RTPCR 3種方法進行了比較，認為RTPCR方法檢測PEDV結果的重復性最好。

國內，吳玉璐[13]等針對PEDV的ORF3基因缺失區(qū)設計引物，建立了可區(qū)分PEDV野毒株與疫苗株的RT- PCR診斷方法，其敏感度可達100TCID50/0.1m L，該方法通過電泳結果根據(jù)電泳條帶的大小即可得出結論。該方法可以用于區(qū)分自然感染的野毒和弱毒疫苗免疫毒株，為PEDV的疫情診斷和流行病學監(jiān)測提供了一種特異、快速的檢測方法。李海利[14]等根據(jù)GenBank中PEDV基因組S基因序列，設計了一對引物（GenBank：AB548624.1），預計擴增基因片段大小為200 bp。結果表明，設計的引物能擴增出目的基因，擴增的基因片段大小與預期的一致，且具有敏感性高、特異性和重復性好等特點。應用建立的條件以及方法，采集臨床疑似病例樣本16份，其中9份擴增出目的條帶，證明此方法具有較好的特異性。該研究為PED的RT- PCR方法的建立提供可靠的依據(jù)。

5 多重PCR技術（mPCR）檢測

多重PCR技術是在傳統(tǒng)PCR技術基礎上建立起來的一種快速、可靠的檢測技術，它既有傳統(tǒng)方法的優(yōu)點—敏感性高、特異性強，但又優(yōu)于傳統(tǒng)方法，該方法可以在反應中同時檢測多種病原，具有簡便、快捷、節(jié)省耗材等優(yōu)點，可廣泛應用于實驗室對多種疫病的鑒別診斷。

國外，Kwonil Jung[15]等用多重反轉錄巢式聚合酶鏈式反應鑒定區(qū)分PEDV和TGEV；Kim等用RT-PCR方法鑒定區(qū)分PEDV和TGEV，檢測靈敏度和特異性均可滿足實驗室診斷的需要。

國內，焦洋[16]等根據(jù)PEDV、TEGV以及PBOV的保守區(qū)基因序列，參考國內外文獻設計并合 成 了3對 引 物：TGEV-S1：5`GTGGTTTTGGTCGTAATGC3`；TGEV-S2：5`ACACTG T G G C A C C C T T A C C T-3`；PEDV-M1：5`-GTCTAACGGTTCTATTCCC-3`；PEDV-M2：5`-TTATAGCCCTCTACAAGG3`；PBOV-NP1：5`-GCAAGGACATCTCCGAAAC-3`；PBOV-NP2：5`-TGAATGCCAGTGAAACCC-3`。建立了可以同時檢測這三種病毒的多重檢測方法，并對部分臨床樣品進行了檢測，檢測結果證明該方法靈敏、特異。應用該研究建立的方法對60份臨床病料進行了檢測，檢出TEGV陽性1份，陽性檢出率為1.6%；PEDV陽性4份，陽性率為6.7%；PBOV 陽性13份，陽性率為21.7%。研究結果表明該方法可用于臨床腹瀉病毒的鑒別診斷。有研究對PEDV、TGEV和PRV進行多重PCR擴增，同時對豬常見的病毒病病原進行PCR擴增，結果顯示多重PCR僅擴增出 PEDV、TGEV和PRV的目的條帶，而未擴增出其他病毒。該研究還應用建立的方法對78份臨床病料進行檢測，檢測到PEDV陽性37份，陽性率為47.44%；TGEV陽性10份，陽性率為12.82%；RV陽性 4份，陽性率為 5.13%；有2份PEDV、TGEV和PRV均為陽性，陽性率為2.56%。該實驗結果表明，陽性樣品的PCR檢測結果出現(xiàn)3條特異性片段，可用于臨床病例的檢測與診斷。

6 熒光定量PCR技術

熒光定量PCR（real-time PCR），是指將熒光基團加入擴增反應體系中，通過實時檢測擴增反應中每一個循環(huán)產物的熒光信號，再利用標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。應用傳統(tǒng)方法進行檢測時，擴增反應后還要要進行染色處理和電泳分離，并且該方法只能定性不能定量，這可能造成污染而出現(xiàn)假陽性。real-time PCR技術不僅進行定量檢測，且具有較高靈敏度、較好特異性，還有可靠性較好、自動化程度更高以及無污染等特點，以上優(yōu)點使得熒光定量有取代常規(guī)方法的趨勢。

實時熒光定量RT－PCR（real-time RT-PCR）是基于傳統(tǒng)PCR基礎上發(fā)展起來的檢測技術，自從該技術的出現(xiàn)，PCR實現(xiàn)了從定性到定量的飛躍。該方法能檢測10個左右病毒粒子，具有較高的靈敏度。另外，還可對PED病料的病毒量進行定量分析，這點可用于疾病的早期診斷和對PEDV 的感染程度進行定量分析。國內，王金良等[17]運用PEDV株FJ473395的M基因序列設計了一對特異性引物，進而建立了SYBR GREENI熒光定量的PCR方法來檢測PEDV，該方法的建立對PEDV初期感染量的診斷提供一定的檢測依據(jù)。有研究建立了兩套實時熒光定量 RT-PCR檢測方法。研究人員用該方法對臨床上采集的20份疑似病例進行檢測，并和常規(guī) PCR方法進行比較，結果顯示常規(guī) PCR檢測20份待檢樣品時，有11 份陽性；實時熒光定量RT-PCR檢測時，有15份陽性，且常規(guī) PCR檢測出的陽性樣品用實時熒光定量 RT-PCR 檢測時均為陽性，符合率為100%。結果證實該方法可對免疫豬群PED 野毒感染和疫苗免疫做出快速準確的鑒別診斷，特別是對PEDV弱毒疫苗免疫后仍暴發(fā)PEDV野毒感染的研究更有臨床意義。

7 環(huán)介導等溫擴增技術檢測

LAMP技術是依賴一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下擴增出 LAMP特有的梯狀條帶。該技術通過鏈置換作用，先利用兩條內引物和兩條外引物，形成莖環(huán)狀DNA結構，然后在內引物的作用下通過環(huán)介導的自動循環(huán)鏈置換反應大量擴增靶序列。LAMP技術的優(yōu)點為耗時短、特異性高、不要求有變性的DNA模板，目前該技術被應用于畜牧業(yè)基層病原體的快速檢測中。LAMP 技術已被國內外廣泛應用于對病原微生物的檢測。

時建立[18]等為實現(xiàn)對 PEDV 的快速檢測，利用PEDV S基因設計特異性引物，建立了檢測PEDV的LAMP快速檢測方法，此方法特異性好，敏感度強，將反轉錄后的病毒cDNA稀釋到108倍仍可檢出，是RT-PCR方法檢出量的100倍。湯小真[19]等針對PEDV的NP基因保守區(qū)設計1套LAMP 擴增引物，該方法可根據(jù)鈣黃綠素顯色肉眼可視化擴增結果，可檢出的最低cDNA的量是3.73 Pg/μL，是RT-PCR方法檢出量的10倍，該方法無需昂貴的儀器設備，適合基層實驗室使用。

綜上所述，PED的防控在PEDV的檢測中，近年來研究的側重點主要是ELISA法和RT-PCR法，這兩種方法以其實用性強、高效、快速、準確而被廣泛應用。尤其是PCR法 ，比ELISA法更加敏感，特異性也較強。盡管PCR法的敏感性和特異性都很好，但由于對儀器設備等要求很高，特別是熒光定量PCR法對實驗操作人員以及實驗條件等的要求較為嚴格，檢測成本也較高，因此在推廣上仍有很大的限制。在實際工作中，可根據(jù)實驗室基礎條件綜合選用合適的檢測方法。

[1] PENSAERT M B，DE BOUCK P.A new corona-virus-like particleassociated withdiarrhea in swine[J]. Arch Virol，1978，58（3）：243-247.

[2] KANG T，SEO J，KIM D，et al.Cloning and sequence analysis of the Korean strain of spike gene of porcine epidemic diarrhea virus and ex-pression of its neutralizing epitope in plants[J]. Protein Expression and Purification，2005，41（2）：378-383.

[3] 施標，董世娟，朱于敏，等. 中國豬流行性腹瀉病毒分子流行病學研究進展[J]. 中國農業(yè)科學，2013，46（20）：4362-4369.

[4] 張生祥，馬文瑞，包守泰，等. 一例豬流行性腹瀉病毒的分離與鑒定[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2015(20)：102-103，229.

[5] 鄭逢梅，霍金耀，趙軍，等.2010-2012年華中地區(qū)豬流行性腹瀉病毒分子特征和遺傳進化分析[J]. 病毒學報，2013，29（2）：197-205.

[6] 陳茹，羅瓊，李樹根，等. 間接法Dot-ELISA檢測豬流行性腹瀉抗體的研究[J]. 中國獸醫(yī)雜志，1997(8)：10-13.

[7] 姜艷平，姜新鵬，孫劉妹，等. 豬流行性腹瀉病毒重組N蛋白間接ELISA檢測方法的建立[J].中國預防獸醫(yī)學報，2015，37(2)：119-122.

[8] 崔現(xiàn)蘭，馬思奇，王明，等.應用免疫熒光法診斷豬流行性腹瀉的研究[J].中國畜禽傳染病，1990(5)：20-24.

[9] 朱維正，鄭瑞峰，等.流行性腹瀉血清學診斷法的研究［J］.中國畜禽傳染病，1990(1) ：16-19.

[10] 林志雄，黃引賢，李樹根，等.應用直接免疫熒光法檢測豬流行性腹瀉病毒的研究［J］.中國進出境動植檢驗，1997(2)：32-34.

[11] WOODS R D. Development of PCR-based techniques to identify porcine transmissible gastroenteritis coronavirus isolates[J].Can J Vet Res，1997，61(3)：167-172.

[12] KIM O， CHOI C， KIM B， et al.Detection and differetiation of porcine diarrhoea virus and transmissible gastroenteritis virus in clinical samples by mp.Ltiplex RTPCR[J].Vet Rec，2000，146(22)：637-640.

[13] 吳玉璐，程群，虞凌雪，等. 豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷方法的建立[J].中國農業(yè)科學，2013 (20)：4370-4377.

[14] 李海利，徐引弟，焦文強，等. 豬流行性腹瀉病毒RT-PCR檢測方法的建立[J]. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2015(8)：46-51.

[15] 焦洋，姜焱，王凱民，等. 豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬博卡病毒多重PCR檢測方法的建立[J]. 動物醫(yī)學進展，2013，34(8)：71-75.

[16] HWONIL J， CHANHEE C. RTPCR-based dot blot hybridization for thedetection and differentiation bettveen porcine epidemic diarrhea virusand transmissible gastroenteritis virus in fecal samples using anonradioactive digoxigenin cDNA probe.Jozwnal of [T]irologicalMethods，2005，123：141-146.

[17] 王金良，郭顯坡，魏鳳，等.SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測豬流行性腹瀉病毒方法的建立及應用[J].中國獸醫(yī)學報，2010，30(10)：1286-1290.

[18] 時建立，彭喆，王莉莉，等. 豬流行性腹瀉病毒LAMP檢測方法的建立及初步應用[J]. 中國動物檢疫，2016，32（7）：82-85，89.

[19] 湯小真，陳露薇，盧榮彬，等. 基于鈣黃綠素顯色的可視化LAMP檢測豬流行性腹瀉病毒的研究[J].中國畜牧獸醫(yī) ，2015，42(2)：331-336.

貴州省農業(yè)攻關項目資助(黔科合支撐[2017]2579號)

葉麗(1990-)，女，碩士研究生，主要從事動物傳染病病原分子生物學的科研學習。

*通訊作者：湯德元（1964-），男，教授，博士，碩士生導師，主要從事動物傳染病病原分子生物學和中西獸醫(yī)結合的教學科研工作。E-mail：tdyuan@163.com

2017-09-05）