應用Illumina-MiSeq高通量測序技術分析脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對小鼠腸道菌群的影響

楊俊花 趙志輝 郭文博 郭晉麗

(上海市農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準與檢測技術研究所，上海201403)

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應用Illumina-MiSeq高通量測序技術分析脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對小鼠腸道菌群的影響

楊俊花 趙志輝*郭文博 郭晉麗

(上海市農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準與檢測技術研究所，上海201403)

本試驗旨在研究脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)對小鼠腸道微生物多樣性、物種豐度的影響。選用平均體重為20 g的BALB/c小鼠40只，隨機分成對照組(灌胃滅菌生理鹽水)和DON組(灌胃1.8 mg/kg BW DON)，每組20個重復，每個重復1只小鼠，連續(xù)灌服28 d。試驗結束后，收集新鮮糞便，每組隨機選取3份，用Illumina-MiSeq高通量測序技術分析微生物群落結構和組成的變化。結果表明，1)與對照組相比，DON組測序數(shù)量減少(P>0.05)。2)DON組降低了Alpha、Beta多樣性，Shannon指數(shù)較對照組顯著降低(P<0.05)。3)在門水平，與對照組相比，DON組顯著降低了擬桿菌門(Bacteroidetes)和脫鐵桿菌門(Deferribacteres)的物種豐度(P<0.05)，顯著提高了變形菌門(Proteobacteria)的物種豐度(P<0.05)。在屬水平，與對照組相比，DON組顯著降低了副類桿菌屬(Parabacteroides)、理研菌屬(Rikenella)、Algoriphagus、Mucispirillum、嗜甲基菌屬(Methylophilus)、Francisella的物種豐度(P<0.05)，顯著提高了梭菌屬(Clostridium)、Robinsoniella、Allobaculum、Akkermansia的物種豐度(P<0.05)。4)聚類分析顯示，DON組與對照組的腸道微生物相似性降低。由此可見，DON能顯著影響小鼠腸道微生物菌群多樣性及物種豐度，提示DON致腸道損傷與這些腸道菌群的變化密切相關。

高通量測序；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；腸道微生物

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)是由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)等在適宜的溫度和濕度條件下產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物[1]，主要存在以小麥、玉米為基礎的食物和飼料中[2]。研究指出，DON毒性雖低于其他真菌毒素，但由于污染普遍、含量高，對人畜具有非常高的危害性[3]。誤食極易引起厭食、嘔吐、腹痛、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)和反應遲鈍等癥狀，長期暴露易導致腸道功能紊亂、生長緩慢、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)損傷、休克死亡等[4-5]，給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。

腸道作為機體與外界物質(zhì)接觸的第一道屏障，不僅可以阻止異型生物質(zhì)如飼料蛋白質(zhì)、天然毒素、微生物以及真菌毒素等的入侵，同時也極易成為外源性物質(zhì)的攻擊靶標。近年來，許多研究都集中在DON對腸道功能的影響，發(fā)現(xiàn)DON可損傷腸道黏膜、破壞腸道屏障和細胞緊密連接、引起腸道炎癥、降低腸道免疫應答、阻礙營養(yǎng)物質(zhì)吸收等[6-7]。

腸道菌群作為腸道重要的組成部分，被譽為是機體自身的黑匣子，其一切的生命活動和代謝情況，如屏障功能、營養(yǎng)作用、免疫應答等都與健康密切相關[8]。然而，目前DON對腸道微生物的影響國內(nèi)外研究鮮有報道。體外試驗表明，DON不影響金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和結腸炎耶爾森桿菌的生長，只對鏈球菌有抑制作用[9]。Waché等[10]研究表明，給豬飼喂DON污染的飼糧可增加厭氧菌的數(shù)量，降低厭氧性亞硫酸鹽還原菌的數(shù)量；Saint-Cyr等[11]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠灌胃DON可顯著降低糞便中大腸桿菌的數(shù)量。但這些研究主要基于體外培養(yǎng)法、毛細管電泳-單鏈構象多態(tài)性(CE-SSCP)法和熒光定量PCR法，并不能充分反映DON對腸道菌群的作用，只局限于一定豐度細菌或特定微生物，對未知微生物均未涉及。因此，本研究選擇高通量數(shù)據(jù)、高檢測深度和高準確率的宏基因組測序技術，結合生物信息學分析技術，旨在定性、定量地研究DON對小鼠腸道結構組成、菌群多樣性和豐度等各方面的影響，探索DON致腸道炎癥、損傷以及營養(yǎng)物質(zhì)吸收障礙的作用機制，篩選腸道暴露DON的敏感菌群和微生物標志物，為飼糧中真菌毒素污染安全評價探索新的路徑和方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

DON標準品：粉末狀，純度≥99%(Pribolab，Singapore)，購自北京普華仁生物技術開發(fā)有限公司，以高壓滅菌水稀釋。糞便DNA提取試劑盒、2×Taq PCR Master Mix購自天根生化科技(北京)有限公司。

主要儀器：Illumina-MiSeq DNA測序儀(Illumina，美國)、紫外分光光度計(Shimadzu，日本)、Sorvall高速離心機(Thermo，美國)、PCR儀(Bio-Red，美國)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Red，美國)。

1.2 試驗動物與飼養(yǎng)管理

BALB/c小鼠40只，6周齡，體重18～22 g，無特定病原體(SPF)級，購自復旦大學實驗動物科學部。室溫維持(23±2) ℃，相對濕度為40%～70%，光照周期12 h，自由飲水和采食，提供高壓滅菌蒸餾水和經(jīng)1.5～2.5 Mrad鈷-60照射除菌的飼料，預飼喂1周。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設計

將40只小鼠隨機分成2組，每組20個重復，每個重復1只小鼠，分籠飼養(yǎng)在無菌隔離器中。分為對照組(灌胃滅菌生理鹽水)和DON組(灌胃1.8 mg/kg BW DON)，試驗劑量設計參考DON對BALB/c小鼠的急性、亞急性毒性結果[15]，每只小鼠每天每次灌胃0.2 mL，試驗持續(xù)28 d。

1.3.2 樣品采集

試驗結束后，固定小鼠，將其尾部提起，用手指輕輕按壓小鼠下腹部，采集新鮮糞便后置于1.5 mL高壓滅菌離心管中，-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3.3 糞便DNA的提取及質(zhì)量檢測

每組分別選取3份糞便樣品，每份準確稱取0.2 g置于2 mL離心管中，采用糞便DNA提取試劑盒提取糞便DNA，紫外分光光度計測定DNA濃度，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測純度，后將DNA樣品送上海派生諾生物科技股份有限公司測序分析。

1.3.4 Illumina-MiSeq宏基因組測序

1.3.4.1 16S rDNA V4區(qū)PCR反應

根據(jù)16S rDNA基因的V4區(qū)保守序列設計通用引物：上游引物為5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′，下游引物為5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′。為區(qū)分每個不同的樣本，在通用引物的上游序列前隨機添加7個核苷酸堿基的序列標簽，即Barcoded-tag，形成Barcoded融合引物。PCR反應體系為：Loading Buffer (10×) 2.5 μL，dNTP 2 μL，DNA模板1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA合成酶0.125 μL，ddH2O 17.375 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目標條帶用DNA切膠回收試劑盒進行回收，得純化樣本，并用BioTek酶標儀測定各樣本濃度并定量。

1.3.4.2 富集并擴增DNA文庫

每個樣品DNA等量混合，采用標準的Illumina TruSeq DNA文庫制備試驗流程構建所需的宏基因組上機文庫，并在Illumina-MiSeq個人基因組分析平臺上進行Barcoded Illumina Miseq測序，采用PE250測序策略。試驗流程為：通過3′—5′核酸外切酶及聚合酶的共同作用，修復帶有突出末端的DNA片段，在修復平整的DNA片段3′末端引入單堿基A，接頭的3′末端含有單堿基T，從而保證DNA片段和接頭能通過A和T配對連接。利用PCR選擇性地富集兩端連有接頭的DNA片段，同時擴增DNA文庫。

1.3.4.3 驗證文庫、上機測序

利用Pico Green和熒光分光光度計定量文庫，多樣品DNA文庫均一化至10 nmol/L后等體積混合，并逐步稀釋定量至4～5 pmol/L后上機測序。

1.4 統(tǒng)計分析

1.4.1 測序基本數(shù)據(jù)處理

對經(jīng)過雙端(pair-end)測序的數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，截斷或舍棄低質(zhì)量序列(50個連續(xù)堿基平均質(zhì)量>Q30，不允許有N)。用軟件Flash連接通過質(zhì)量控制的序列，舍棄無法連接的序列。對選擇通過的序列進行過濾，過濾原則為：舍棄堿基長度在200～1 000之外的、含有模糊堿基的、含有錯配堿基的、連續(xù)相同堿基>6，模糊堿基>1的序列，獲得最終用于分析的序列。

1.4.2 生物分類及統(tǒng)計分析

應用Qiime分析軟件，根據(jù)序列的相似度，將序列歸為多個操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)。Qiime調(diào)用Uclust對序列進行聚類，選取每個類最長的序列為代表序列。采用RDP-classifier，以RDP數(shù)據(jù)庫的序列為訓練集，對OTU代表序列進行注釋。

物種豐度按屬層次進行歸類計算，先對物種豐度進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換，接著再將轉(zhuǎn)換后的數(shù)值與單樣品豐度平均值之差除以單樣品豐度標準差，完成數(shù)據(jù)標準化。將數(shù)據(jù)導入SPSS 19，采用方差分析(ANOVA)、t檢驗和LSD多重比較法進行統(tǒng)計分析，P<0.05為存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 DON對小鼠腸道微生物測序數(shù)據(jù)的影響

表1結果顯示，經(jīng)過16S rDNA V4區(qū)的Illumina Miseq雙端測序，對照組和DON組分別獲得有效序列86 146.23和84 594.98條，其中優(yōu)質(zhì)序列分別為85 843.64和84 305.31條，DON組較對照組檢測序列減少，但統(tǒng)計學差異不顯著(P>0.05)。反映97%相似度下樣品取樣深度的稀釋曲線見圖1，每個樣品均在80 000條左右，表明取樣深度一致。所測序列長度集中在178～268 bp之間，平均長度為226 bp，見圖2。

表1 小鼠糞便樣本測序數(shù)量分析

同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 小鼠腸道微生物豐度分布曲線圖

對各樣本的OTU豐度大小排序，取log2的對數(shù)值作豐度分布曲線圖，見圖3，結果發(fā)現(xiàn)對照組和DON組樣本中物種分布均勻，可用于多樣性分析。

2.3 DON對小鼠腸道微生物菌群Alpha多樣性的影響

將2組樣品所有序列按97%的相似度進行OTU聚類，利用程序運算得到評價微生物Alpha多樣性豐度和均度的Shannon指數(shù)，見圖4。結果發(fā)現(xiàn)，DON組Shannon指數(shù)降低，與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

2.4 DON對小鼠腸道微生物菌群Beta多樣性的影響

Beta多樣性是不同生態(tài)系統(tǒng)之間多樣性的比較，是物種組成沿環(huán)境梯度或在群落間的變化率，用來表示生物種類對環(huán)境異質(zhì)性的反應。經(jīng)主坐標分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)方法分析，見圖5，結果顯示DON組與對照組能顯著區(qū)分，并且菌群結構(藍色)分布緊湊、相似度高，多樣性較對照組降低。

2.5 物種豐度差異性分析

為探討DON對腸道微生物群落結構和組成的影響，在門和屬2個層次上對同類的OTU進行聚類比較研究。表2和圖4結果顯示，在門水平上，擬桿菌門(Bacteroidetes)的物種豐度與對照組相比顯著降低(P<0.05)，在總?cè)郝渲械恼急扔?5.01%降低到35.25%；脫鐵桿菌門(Deferribacteres)的物種豐度與對照組相比也顯著降低(P<0.05)，占比由0.76%降低到0.39%。軟壁菌門(Tenericutes)的物種豐度也呈降低趨勢，與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。變形菌門(Proteobacteria)的物種豐度與對照組相比顯著提高(P<0.05)，占比由6.66%提高到8.78%。疣微菌門(Verrucomicrobia)的物種豐度則呈上升趨勢，與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。對照組厚壁菌門(Firmicutes)在總?cè)郝渲械恼急葹?3.05%，DON組Firmicutes的占比則上升到50.41%，但物種豐度統(tǒng)計學差異不顯著(P>0.05)。

C1、C2、C3為對照組樣本1、2、3；T1、T2、T3為DON組樣本1、2、3。下圖同。

C1, C2 and C3 indicates the sample 1, sample 2 and sample 3 in control group; T1, T2 and T3 indicates the sample 1, sample 2 and sample 3 in DON group. The same as below.

圖1 小鼠糞便樣本測序序列稀釋曲線(相似度：97%)

Fig.1 Rarefaction curve of sequenced reads in feces of mice (similarity: 97%)

圖2 測序序列長度分布

表3結果顯示，在屬的水平上，與對照組相比，DON組顯著降低了副類桿菌屬(Parabacteroides)、理研菌屬(Rikenella)、Algoriphagus、Mucispirillum、嗜甲基菌屬(Methylophilus)、Francisella的物種豐度(P<0.05)，顯著提高了梭菌屬(Clostridium)、Robinsoniella、Allobaculum、Akkermansia的物種豐度(P<0.05)。同時，DON組還影響了短桿菌屬(Brevibacterium)、糞球菌屬(Coprococcus)、Kordiimonas、Pusillimonas、厭氧原體屬(Anaeroplasma)的物種豐度，但與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。

圖3 小鼠糞便樣品樣本OTU豐度曲線圖

*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

* indicates significant difference compared with control groups (P<0.05).

圖4 DON處理后腸道微生物菌群的Shannon指數(shù)變化

Fig.4 Change of Shannon diversity indexes of intestinal microbes exposed to DON

圖5 DON處理后腸道微生物Beta多樣性變化

門Phylum對照組ControlgroupDON組DONgroup相對倍數(shù)變化Relativefoldchange/[log(C/T,2)]P值P-value擬桿菌門Bacteroidetes33534.20±8510.69a28922.44±1495.53b0.2130.01脫鐵桿菌門Deferribacteres555.45±46.06a378.73±95.61b0.5530.02變形菌門Proteobacteria5294.64±587.99b6441.51±841.95a0.2830.01軟壁菌門Tenericutes234.10±80.28148.46±16.540.6570.07疣微菌門Verrucomicrobia680.95±35.772472.37±474.48-1.8600.06

C為對照組，T為DON組。下表同。

C represents the control group, T represents the DON group. The same as below.

此外，圖6呈現(xiàn)了腸道微生物菌群在屬水平的物種間相似性聚類關系(heatmap)，結果表明DON組小鼠腸道微生物結構發(fā)生改變，與對照組相似性差異顯著，與表3結果一致。

圖7 DON處理后腸道微生物結構區(qū)系圖的變化

屬Genus對照組ControlgroupDON組DONgroup相對倍數(shù)變化Relativefoldchange/[log(C/T,2)]P值P-value短桿菌屬Brevibacterium0.63±0.561.25±0.48-0.9760.09副類桿菌屬Parabacteroides1806.26±607.93a937.05±281.09b0.9460.03文肯菌屬Rikenella550.72±90.21a323.72±14.15b0.766<0.01Algoriphagus3.90±1.61a1.30±1.08b1.5840.04Mucispirillum555.45±46.06a378.73±95.61b0.5520.03梭菌屬Clostridium0.01±0.00b1.41±0.69a-10.4680.03糞球菌屬Coprococcus0.36±0.140.83±0.09-1.1710.09Robinsoniella121.38±60.49b390.96±230.81a-1.6870.04Allobaculum0.92±1.61b3.01±2.64a-1.0790.04Kordiimonas2.28±1.063.26±1.77-0.5110.08Pusillimonas0.01±0.000.82±0.09-1.2320.08嗜甲基菌屬Methylophilus26.70±8.5618.78±1.720.5070.05Francisella1.01±0.13a0.33±0.00b1.5850.01厭氧原體屬Anaeroplasma233.38±80.52148.22±66.540.6550.09Akkermansia650.57±239.46b2446.55±1277.54a-1.9110.05

3 討 論

動物腸道中棲居著大量的微生物菌群，不僅與宿主機體之間保持著一種動態(tài)平衡，不同菌群之間也存在著一定的比例關系。菌群的穩(wěn)態(tài)對維持機體生長發(fā)育、營養(yǎng)消化吸收、免疫拮抗等生理功能都具有重要的影響[12]。本試驗應用Illumina-MiSeq高通量測序技術，突破傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法和以16S rDNA為基礎的分子生物學方法，可產(chǎn)生覆蓋廣、深度深的測序數(shù)據(jù)，并通過比對或聚類分析，判定微生物群落物種組成的變化，同時挖掘低豐度或未知的細菌，能更加全面、準確地獲得敏感菌群信息，對準確判定DON對腸道微生物毒性作用具有重要意義。

3.1 DON對腸道菌群多樣性的影響

腸道微生物多樣性是促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收、維持機體免疫和新陳代謝的基礎，多樣性降低極易對宿主免疫產(chǎn)生影響，進而影響健康[13]。本研究指出，灌胃DON后小鼠腸道微生物測序數(shù)量2組之間沒有顯著差異，但DON組的有效序列和優(yōu)質(zhì)序列均較對照組降低，說明腸道微生物的種類有所減少。此外，DON組反映Alpha多樣性豐度和均度的Shannon指數(shù)顯著降低，PCoA方法分析Beta多樣性發(fā)現(xiàn)DON組菌群結構分布緊湊，多樣性降低。但Waché等[10]和Piotrowska等[14]的研究表明，飼糧添加DON處理不影響豬腸道菌群的豐度和多樣性，不同的結果可能是由于檢測方法、DON添加劑量和動物的種屬等差異引起的。課題組前期研究指出灌胃DON后，腸道氨基酸、礦物元素等營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率降低，小鼠體重減輕，免疫機能下降[15]，推測與DON致小鼠腸道微生物多樣性降低有關。

3.2 DON對腸道微生物菌群結構和物種豐度的影響

本研究通過Illumina-MiSeq測序技術檢測小鼠糞便中微生物菌群結構和組成的變化，結果顯示DON處理后小鼠腸道微生物物種豐度發(fā)生顯著變化，并呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。人類腸道中的優(yōu)勢菌群分別為Bacteroidetes和Firmicute，在腸道菌群所占的比例約90%以上，小鼠腸道2個菌門的占比為85%[16]，本試驗中小鼠腸道Bacteroidetes和Firmicutes菌門占80%以上，DON處理后2個優(yōu)勢菌門的總占比沒有變化，但Bacteroidetes的物種豐度較對照組顯著降低。Bacteroidetes是一類具有促進碳水化合物發(fā)酵，參與糖類、膽汁酸和類固醇代謝等功能的菌群[17]，Wang等[18]給大鼠灌胃黃曲霉毒素B1能顯著抑制腸道中Bacteroidetes相關菌群豐度，在腸道炎癥或潰瘍時Bacteroidetes的物種豐度也顯著降低[19]，與本研究結果一致。此外，Deferribacteres的物種豐度降低，Proteobacteria的物種豐度提高。高脂肪飼糧誘導的非酒精性脂肪肝模型小鼠，Proteobacteria的物種豐度也增加，反映腸黏膜完整性的緊密連接蛋白occludin表達降低，提示腸道損傷發(fā)生[20]。綜合這些結果表明DON可能與黃曲霉毒素、高脂飼糧一樣可引起腸道菌群豐度發(fā)生改變，進而誘導腸道炎癥，引發(fā)腸道損傷。

在屬的水平，與對照組相比，DON組顯著降低了Parabacteroides、Rikenella、Algoriphagus、Mucispirillum、Methylophilus、Francisella的物種豐度。多有研究指出，這些菌屬物種豐度的降低與腸道疾病密切相關。Noor等[21]指出潰瘍性結腸炎患者比正常人的糞便微生物中Parabacteroides菌屬表達水平較低，并推測此菌屬的缺失可能與腸道炎癥有關。目前腸道中Rikenella的作用還沒有明確，但有研究指出Rikenellaceae是腸道內(nèi)具有保護性功能的菌群[22]，本試驗Rikenella的物種豐度顯著降低，提示DON有抑制腸道有益菌的作用。Mucispirillum作為腸道細菌群落標志物，在腸炎早期或抗生素應用時豐度顯著降低[23]，與本試驗DON使腸道Mucispirillum的物種豐度降低結果相同。推測，小鼠灌胃DON可使腸道Parabacteroides和Mucispirillum炎癥敏感菌群以及有益菌Rikenella的物種豐度降低，進而引起腸道炎癥發(fā)生，導致腸道損傷同時危害機體健康。

此外，DON還降低了腸道中Algoriphagus、Methylophilus和Francisella的物種豐度，由于這些菌屬在腸道中的占比較低，分離培養(yǎng)技術不成熟，其功能作用研究也鮮有報道，故有待進一步探索研究。

DON灌胃后顯著提高了Clostridium、Robinsoniella、Allobaculum以及Akkermansia的物種豐度，許多研究表明這些菌屬的變化也與腸道感染和炎癥密切相關。Clostridium是厚壁菌門的一個菌屬，包含產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌等多種致病菌，可產(chǎn)生外毒素，對人和動物都有較強的毒害作用。Piotrowska等[14]給豬飼喂DON污染的飼糧發(fā)現(xiàn)結腸內(nèi)容物中產(chǎn)氣莢膜梭菌含量增加，提示DON可誘導腸道中致病菌含量增加。Robinsoniella被認為是臨床腸道感染的繼發(fā)性入侵者，在傷口感染部位或菌血癥患者血液均可分離得到[24]。在白細胞介素-10(IL-10)基因敲除的腸炎小鼠模型，腸道Robinsoniellapeoriensis的物種豐度也顯著提高[25]，而本研究腸道微生物中Robinsoniella的物種豐度增加，表明DON有誘發(fā)腸道炎癥和感染的可能。Allobaculum盡管在腸道微生物中的占比較低，但有研究指出高膽固醇飼糧誘導的腸炎性小鼠腸道中Allobaculumde的物種豐度增加，并且Allobaculum的物種豐度與抗炎因子的表達呈負相關[26]。Zhou等[27]給小鼠灌胃地溝油后腸道黏膜損傷并誘發(fā)腸炎，Allobaculum豐度也顯著提高，與本研究DON誘導腸道Allobaculum豐度增加結果一致。Akkermansia是近年來研究熱門的一個菌屬，作為是疣微菌門的優(yōu)勢菌群，約占83%，占總腸道微生物的1%～4%[28]，以腸道上皮黏蛋白為碳源和氮源，能削弱腸道黏液屏障的厚度[29-30]。多有研究發(fā)現(xiàn)超重或者肥胖者腸道中Akkermansia的物種豐度降低，推測腸道中Akkermansia有減緩脂肪沉積，減輕體重的作用[31-32]。楊俊花等[15]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠灌胃DON后，體重顯著降低。此外，Akkermansia還可干擾宿主黏膜平衡而加劇鼠傷寒沙門氏菌誘發(fā)的腸道炎癥[33]。推斷DON作用使小鼠體重減輕及腸道炎癥發(fā)生，可能與腸道Akkermansia的物種豐度增加有關。

目前為止，DON致腸道炎癥的報道較多，主要集中在DON使腸絨毛高度降低、隱窩減少、腸上皮細胞炎性因子白細胞介素-12(IL-12)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達增加等[34-35]。但這些研究均沒有涉及腸道微生物菌群的變化，DON致腸道菌群豐度變化是否與腸道炎癥有直接的關系，還有待我們進一步驗證。此外，鑒于Parabacteroides和Mucispirillum的物種豐度降低和Clostridium、Robinsoniella、Allobaculum、Akkermansia的物種豐度提高與腸道感染、炎癥的相關性，故可以將這些菌群豐度的變化作為DON引發(fā)腸道炎癥、危害腸道健康的菌群標志物。

4 結 論

① DON灌胃處理后，小鼠腸道微生物菌群豐度減少，Alpha多樣性和Beta多樣性降低。

② 在門水平，與對照組相比，DON組顯著降低了Bacteroidetes和Deferribacteres的物種豐度，顯著提高Proteobacteria的物種豐度。在屬水平，與對照組相比，DON組顯著降低Parabacteroides、Rikenella、Mucispirillum的物種豐度，顯著提高了Clostridium、Robinsoniella、Allobaculum、Akkermansia的物種豐度。

③ 腸道中這些菌屬豐度的變化與腸道炎癥密切相關，提示這些菌屬可能是DON引發(fā)腸道炎癥的菌群標志物。

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*Corresponding author, professor, E-mail: zhao9912@hotmail.com

(責任編輯 武海龍)

Effects of Deoxynivalenol on Intestinal Microbiota of Mice Analyzed by Illumina-MiSeq High-Throughput Sequencing Technology

YANG Junhua ZHAO Zhihui*GUO Wenbo GUO Jinli

(InstituteofAgri-FoodStandardsandTestingTechnology,ShanghaiAcademyofAgriculturalSciences,Shanghai201403,China)

This study was conducted to investigate the effects of deoxynivalenol (DON) on bacterial diversity and species abundance of intestinal microbiota. A total of 40 BALB/c mice weighted about 20 g were randomly allotted to control group (intragastric gavage sterilized saline) and DON group (intragastric gavage 1.8 mg/kg BW DON) with 20 replicates per group and 1 mouse per replicate. The mice were fed by intragastric administration for 28 days. After the test, fresh fecal samples were collected and 3 samples in each group were randomly selected for investigating the microbial community and composition by using Illumina-MiSeq high-throughput sequencing technology. The results showed as follows: 1) the quantities of sequences observed in DON group was less than that in control group (P>0.05). 2) The Alpha and Beta diversity were respectively reduced in DON group, and the Shannon index was also significantly decreased compared with the control group (P<0.05). 3) At the phylum level, compared with the control group, the abundances of Bacteroidetes and Deferribacteres in DON group were significantly decreased (P<0.05), while the abundance of Proteobacteria was significantly increased (P<0.05). At the genus level, compared with the control group, the abundances ofParabacteroides,Rikenella,Algoriphagus,Mucispirillum,MethylophilusandFrancisellain DON group were significantly decreased (P<0.05), but the abundances ofClostridium,Robinsoniella,AllobaculumandAkkermansiain DON group were significantly increased (P<0.05). 4) The cluster analysis showed low similarity of intestinal microflora between the control and DON group. In conclusion, the bacterial diversity and species abundance of intestinal microbiota can be influenced by DON, and it is suggested that the intestinal lesions caused by consumption of DON may be related with the change of intestinal bacteria communities.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(1)：158-167]

high-throughput sequencing; deoxynivalenol; intestinal microbiota

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.01.018

2016-07-21

上海市農(nóng)委科技興農(nóng)重點攻關項目[滬農(nóng)科攻字(2013)第3-8號]；上海市農(nóng)委青年人才成長計劃[滬農(nóng)青字(2015)第1-33號]

楊俊花(1980—)，女，山西清徐人，博士，研究方向為真菌毒素毒理學。E-mail: yangjunhua303@126.com

*通信作者：趙志輝，研究員，E-mail: zhao9912@hotmail.com

S811.6

A

1006-267X(2017)01-0158-10