復(fù)方莪術(shù)散對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥黏附因子表達(dá)的影響

薛麗霞

天津中醫(yī)藥大學(xué)(天津300193)

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·實(shí)驗(yàn)研究·

復(fù)方莪術(shù)散對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥黏附因子表達(dá)的影響

薛麗霞

天津中醫(yī)藥大學(xué)(天津300193)

目的:觀察子宮內(nèi)膜異位癥ICAM-1的表達(dá)情況，并探討復(fù)方莪術(shù)散對(duì)其表達(dá)的影響。方法 :建立子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型，WB檢測(cè)不同子宮內(nèi)膜組織ICAM-1的表達(dá)；并取異位細(xì)胞進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，同時(shí)用高中低劑量復(fù)方莪術(shù)散干預(yù)子宮內(nèi)膜異位癥異位原代培養(yǎng)細(xì)胞，分別在24 h、48h和72 h利用WB檢測(cè)ICAM-1的表達(dá)情況。結(jié)果: WB結(jié)果顯示，與非內(nèi)異癥大鼠正常子宮內(nèi)膜組織相比，子宮內(nèi)膜異位癥大鼠在位組織和異位組織ICAM-1相對(duì)表達(dá)量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中異位組織較在為組織ICAM-1升高更為明顯(P<0.05和<0.01)。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)顯示，高中低劑量復(fù)方莪術(shù)散干預(yù)組表達(dá)明顯降低，差異具有顯著性(P<0.05)。結(jié)論: ICAM-1蛋白子宮內(nèi)膜異位內(nèi)膜組織呈現(xiàn)高表達(dá)，而復(fù)方莪術(shù)散能夠有效抑制子宮內(nèi)膜異位內(nèi)膜細(xì)胞ICAM-1蛋白的表達(dá)，為治療子宮內(nèi)膜異位提供了良好的方法。

子宮內(nèi)膜異位癥簡(jiǎn)稱內(nèi)異癥，其典型病理特征是子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)出現(xiàn)在子宮內(nèi)膜以外的部位，且生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、反復(fù)出血，可形成結(jié)節(jié)及包塊，是引起疼痛和不育的主要原因[1]。據(jù)估計(jì)育齡婦女中內(nèi)異癥的流行率約為10%～15%，而50～60%各種形式盆腔痛的育齡女性和青春期女性和50%的不育女性均合并內(nèi)異癥[2]。內(nèi)異癥雖然為良性病變，卻具有惡性行為，復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重影響女性的身心健康[3]。目前，其病因和致病機(jī)制復(fù)雜，有子宮內(nèi)膜種植學(xué)說(shuō)、體腔上皮化生學(xué)說(shuō)、淋巴和靜脈播散學(xué)說(shuō)等[4]。其中，“經(jīng)血逆流種植”學(xué)說(shuō)最為經(jīng)典。異位的子宮內(nèi)膜通過(guò)“黏附-侵襲-血管生成”侵襲其他部位[5]，其間涉及眾多粘附因子包括細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)、CD44、CA125、CA199等。研究顯示，異位內(nèi)膜ICAM-1和CD44表達(dá)增高[6]。中醫(yī)認(rèn)為血瘀是該病致病的關(guān)鍵。中藥方劑復(fù)方莪術(shù)散具有補(bǔ)腎活血、軟堅(jiān)散結(jié)等功效，治療內(nèi)異癥具有良好效果[7]。本研究通過(guò)建立子宮內(nèi)膜異位大鼠模型觀察病變組織ICAM-1表達(dá)的變化，然后利用不同劑量復(fù)方莪術(shù)散干預(yù)子宮內(nèi)膜異位癥異位細(xì)胞并其對(duì)ICAM-1表達(dá)的影響，以確證其對(duì)黏附作用的影響。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級(jí)雌性SD大鼠(由上海生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證：SYXK滬2004-0012)、苯甲酸雌二醇、異戊巴比妥那、大鼠飼料(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司)、復(fù)方莪術(shù)散(方藥組成：三棱、莪術(shù)、淫羊藿、延胡索、黃芪，組方中個(gè)單藥劑量由江陰天江藥業(yè)有限公司制成顆粒劑型，其中低劑量各單藥5 g， 中劑量10 g,高劑量20 g)、DMEM培養(yǎng)基、組織勻漿器、RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)公司)、RIPA蛋白裂解液(碧云天生物技術(shù)公司)、β-actin抗體(碧云天生物技術(shù)公司)、抗ICAM-1抗體(Sigma公司)、HRP-山羊抗小鼠二抗(碧云天生物技術(shù)公司)、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)、

2 子宮內(nèi)膜異位大鼠模型建立 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為6～8周齡，健康成熟未交配的清潔級(jí)雌性SD大鼠，平均體重165～182 g，按照清潔級(jí)動(dòng)物要求進(jìn)行飼養(yǎng)，自由取水，室溫24℃，相對(duì)濕度50±10%，明暗照明各12 h，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飲食2周。動(dòng)物模型建立參照文獻(xiàn)[8]，簡(jiǎn)要步驟如下：按照30 μg/kg劑量連續(xù)皮下注射苯甲酸雌二醇3D，陰道涂片觀察以確定大鼠動(dòng)情期，在動(dòng)情期進(jìn)行手術(shù)造模。按60 mg/kg劑量腹腔注射異戊巴比妥那進(jìn)行麻醉，無(wú)菌條件下剖腹，結(jié)扎子宮系膜血管，左側(cè)子宮縱向切開(kāi)，分離出子宮內(nèi)膜0.5 cm× 0.5cm并縫合于右側(cè)腹腔內(nèi)壁血管豐富處。術(shù)后三周剖腹，測(cè)量異位內(nèi)膜體積，以體積≥20 mm3、內(nèi)膜囊泡見(jiàn)透明積液為造模成功。

3 細(xì)胞培養(yǎng)及低、中、高劑量復(fù)方莪術(shù)散干預(yù)處理 選取建模成功大鼠異位子宮內(nèi)膜組織保存在DMEM培養(yǎng)液中，2h內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)處理。細(xì)胞原代培養(yǎng)方法參照Ryan[9]等的方法，簡(jiǎn)要步驟如下：PBS將內(nèi)膜組織洗滌3次；用眼科剪將其剪成碎塊，加入2～5倍體積的消化液(含1%膠原酶和0.25%胰蛋白酶)，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化90 min，至可見(jiàn)葡萄串狀上皮細(xì)胞及單個(gè)間質(zhì)細(xì)胞。將消化好的細(xì)胞懸液離心去上清，加入DMEM漂洗沉淀2次后，加入DMEM完全培養(yǎng)基，吹打混勻后接種于培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。應(yīng)用免疫組化染色法鑒定上皮細(xì)胞(角質(zhì)蛋白染色)和間質(zhì)細(xì)胞(波形蛋白染色)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)細(xì)胞分別應(yīng)用含低、中、高濃度的復(fù)方莪術(shù)散DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24 h，48 h及72 h后，收集細(xì)胞。

4 WB檢測(cè)ICAM-1表達(dá)

4.1 細(xì)胞和組織蛋白的提取組織蛋白提?。悍謩e取適量非內(nèi)異癥大鼠正常子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜異位癥在位組織和異位組織至勻漿器球狀部位，用干凈組織剪將其剪碎；加入400μl RIPA裂解液(碧云天生物科技有限公司)于勻漿器中，冰上勻漿；冰上裂解30 min，將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中，超聲10～15 s后，4℃，12,000rpm 離心5 min，收集上清于離心管中，-20℃保存?zhèn)溆?。?xì)胞蛋白提?。簩⑾鄳?yīng)處理時(shí)期的細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，加預(yù)冷PBS洗2次，將PBS棄凈后置于冰上，加RIPA裂解液200μl冰上裂解30 min。刮取細(xì)胞并將裂解液轉(zhuǎn)移至EP管中，超聲10～15 s后，4℃，12,000rpm 離心5 min，收集上清于離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.2 WB檢測(cè):應(yīng)用WB檢測(cè)組織和細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)情況，簡(jiǎn)要步驟如下：利用將10%的蛋白電泳分離膠和4%的蛋白電泳濃縮膠進(jìn)行蛋白電泳；用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜； 用8%脫脂混勻牛奶封閉2 h；按1∶1 000稀釋?duì)?actin抗體和抗ICAM-1抗體，4℃孵育過(guò)夜；洗滌過(guò)后1∶10 000比例用TBST稀釋結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育2 h；洗滌后曝光顯影。用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的條帶，并用ImageJ圖像采集分析系統(tǒng)計(jì)算WB灰度值，以樣品條帶/β-actin相對(duì)含量為蛋白含量的表達(dá)。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞形態(tài)觀察 細(xì)胞體外培養(yǎng)24 h后，大部分上皮細(xì)胞已貼壁呈團(tuán)狀生長(zhǎng)排列，腺細(xì)胞呈多角形或蝌蚪形，為致密的細(xì)胞集落，邊界清楚。間質(zhì)細(xì)胞為多角形或梭形。

2 子宮內(nèi)膜異位大鼠不同子宮內(nèi)膜組織ICAM-1表達(dá) WB結(jié)果顯示，與非內(nèi)異癥大鼠正常子宮內(nèi)膜組織相比，子宮內(nèi)膜異位癥大鼠在位組織和異位組織ICAM-1相對(duì)表達(dá)量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中異位組織較在為組織ICAM-1升高更為明顯(p<0.05和<0.01)，見(jiàn)圖1。

圖1 不同子宮內(nèi)膜組織ICAM-1表達(dá)

2 復(fù)方莪術(shù)散對(duì)子宮內(nèi)膜異位原代細(xì)胞ICAM-1表達(dá)的影響 WB結(jié)果顯示，空白對(duì)照組ICAM-1蛋白高表達(dá)；復(fù)方莪術(shù)散高劑量干預(yù)組與空白對(duì)照比較，復(fù)方莪術(shù)散高、中、低劑量干預(yù)組ICAM-1蛋白表達(dá)量明顯減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 不同劑量復(fù)方莪術(shù)散干預(yù)后細(xì)胞ICAM-1表達(dá)變化

注：與空白組比較，*P<0.05

討 論

復(fù)方莪術(shù)散包括莪術(shù)、三棱、淫羊藿、延胡索和黃芪5味中藥，活血化瘀、行氣止痛、益腎扶正[10]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，該藥可降低異位內(nèi)膜血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，抑制新生血管形成及病灶侵襲[11]。ICAM-1是一種淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1的配體，含有505個(gè)氨基酸，屬于細(xì)胞粘附分子中的免疫球蛋白超級(jí)家族一員，廣泛存在于細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)包括子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)。其不僅可以介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞間黏附作用，也參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、血管生長(zhǎng)、炎癥反應(yīng)等生理和病例過(guò)程[12]。子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞有較多的ICAM-1表達(dá)。多種研究證實(shí)，該蛋白在內(nèi)異癥患者血清中明顯升高[13]；在異位病灶中高表達(dá)[5, 14]。該蛋白可能在內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

本研究成功建立了子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型，并觀察了ICAM-1在非內(nèi)異癥大鼠正常子宮內(nèi)膜組織、在位組織(P<0.05)和異位組織的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥在位組織和異位組織ICAM-1的表達(dá)均增高，其中異位組織ICAM-1增高最多，提示ICAM-1可能在內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展中起著在重要作用。同時(shí)，本研究利用不同劑量復(fù)方莪術(shù)散干預(yù)子宮內(nèi)膜異位內(nèi)膜細(xì)胞，并觀察了其對(duì)ICAM-1蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)方莪術(shù)散能有效抑制該蛋白在子宮內(nèi)膜異位內(nèi)膜細(xì)胞的表達(dá)，提示復(fù)方莪術(shù)散治療子宮內(nèi)膜異位癥有重要作用。其可能通過(guò)抑制ICAM-1蛋白表達(dá)，影響異位子宮內(nèi)膜的黏附從而達(dá)到治療的效果。

綜上所述，ICAM-1在子宮內(nèi)膜異位癥在位組織和異位組織升高，而復(fù)方莪術(shù)散能夠有效抑制子宮內(nèi)膜異位內(nèi)膜細(xì)胞ICAM-1蛋白的表達(dá)，為治療子宮內(nèi)膜異位提供了良好的方法。

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(收稿：2016-09-22)

The effect of compound rhizome curcumae power on intercellular adhesion molecule-1 in endometriosis

Xue Lixia.

Tianjin University of Traditional Chinese Medicine (Tianjin 300193)

Objective:To observe the expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) in endometriosis and study the effect of compound rhizome curcumae power on ICAM-1. Methods :The endometriosis rat model was established and we used WB to detect the expression of ICAM-1 in different endometriosis tissues; then we collected the cells of endometriosis and cultured. The cultured endometriosis cells were treated with low, middle and high concentration of compound rhizome curcumae power and the ICAM-1 expression was detected by WB at 24h, 48h and 72h after treated. Results:WB showed that compared with normal tissues, there were significantly higher ICAM-1 expression in ectopic and eutopic endometrium tissue (P<0.05), but more higher in ectopic tissue (P<0.01). And independent sample t test showed the expression of ICAM-1 were lower in the cultured endometriosis cells treated with low, middle and high concentration of compound rhizome curcumae power. Conclusion: The expression of ICAM-1 is higher in endometriosis tissues and compound rhizome curcumae power could effectively depress the expression of ICAM-1, which gives good method for the treatment of endometriosis.

Endometriosis @Compound rhizome curcumae power Intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) Animal ，Experimentation Rats

子宮內(nèi)膜異位癥 @復(fù)方莪術(shù)散 細(xì)胞間粘附因子-1 動(dòng)物，實(shí)驗(yàn) 大鼠

R711.71

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.01.061