基于三(2-氨基乙基)胺和6-羧基熒光素的雙模式核磁共振成像造影劑

潘 斐, 朱 勤, 錢偉橋, 胡愛國

(華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,上海市先進(jìn)聚合物材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237)

基于三(2-氨基乙基)胺和6-羧基熒光素的雙模式核磁共振成像造影劑

潘 斐, 朱 勤, 錢偉橋, 胡愛國

(華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,上海市先進(jìn)聚合物材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237)

通過將三(2-氨基乙基)胺(TREN)、6-羧基熒光素與溴乙酸芐酯結(jié)合而合成出多胺多羧型配體,并賦予化合物熒光成像的功能。進(jìn)一步與順磁性的六水合氯化釓(Ⅲ)反應(yīng)獲得兼具核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)和光學(xué)成像功能的雙模式核磁共振成像造影劑。通過核磁氫譜、碳譜、高分辨質(zhì)譜和ICP-AES表征了配體和金屬配合物的結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果表明,該配合物的縱向弛豫率(r1)為3.46 mM-1·s-1,與小分子型商用造影劑如馬根維顯?(Gd-DTPA)接近。該配合物同時(shí)擁有66%的熒光量子產(chǎn)率,在紫外光照射下顯示明亮的綠色熒光,為以后進(jìn)行生物體內(nèi)研究打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

核磁共振成像; 造影劑; 三(2-氨基乙基)胺; 熒光成像; 量子產(chǎn)率

Lauterbur和Mansfield因在核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)領(lǐng)域[1-2]作出開拓性貢獻(xiàn)而榮獲2003年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。MRI具有高的空間分辨率、較深的組織穿透力以及對人體檢測無創(chuàng)傷性等特點(diǎn),成為當(dāng)前最有效的醫(yī)學(xué)診斷手段之一[3-6]。在很多核磁共振成像(MRI)檢測中,比如腸胃管和腦部區(qū)域,由于軟組織間的區(qū)分度不夠高而使得診斷信息不夠充分。在這些情形下,需要用到造影劑(Contrast agent)以提高診斷影像的質(zhì)量。含有順磁性金屬離子可以通過改變?nèi)梭w組織中水質(zhì)子的弛豫速率,增強(qiáng)正常組織和病變組織的對比度,從而提高M(jìn)RI的成像效果。臨床實(shí)踐中有將近一半的MRI需要用到造影劑,而這些造影劑大多為釓(III)配合物[7-8]。釓(III)造影劑的靈敏度可以用單位濃度造影劑對水分子弛豫速率的影響,即弛豫率(r1)來表征。根據(jù)SBM (Solomon-Bloembergen-Morgan)理論[9],影響造影劑弛豫率的因素主要有以下3個(gè):水合常數(shù)q、配位水分子的停留時(shí)間τm和造影劑的旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間τR。其中縮短τm或者延長τR是目前提高造影劑弛豫率研究的主流方法。雖然造影劑的加入能有效地提高組織分辨率,但是卻無法解決MRI本質(zhì)上存在的一個(gè)缺點(diǎn):較低的靈敏度。與之相反,光學(xué)成像(Optical imaging)的組織穿透性很差,卻具有很高的靈敏性。為此,許多研究者們開展了將這兩種成像手段結(jié)合的雙模式成像研究以獲得更好的診斷效果。

小分子有機(jī)熒光團(tuán)、金屬配合物發(fā)光體、碳量子點(diǎn)等都可以通過共價(jià)鍵或者非共價(jià)鍵的方式與釓配合物鏈接起來而成為符合這種要求的雙模式造影劑。Rivas等[10]通過酰胺鍵將基于DO3A的釓配合物與熒光基團(tuán)羅丹明鏈接起來獲得雙模式造影劑。Jang等[11]以二乙三胺(DTTA)作為核磁共振探針,以萘亞胺作為熒光基團(tuán),均賦予了造影劑光學(xué)成像的功能。我們研究組通過細(xì)乳液聚合方式將釓配合物接枝在5-丙烯酰氨基熒光素和苯乙烯共聚形成的聚合物納米粒子上,獲得雙模式造影劑[12]。Livramento等[13]以4,4'-雙(溴甲基)-2,2'-聯(lián)吡啶作為結(jié)構(gòu)核心,一端修飾為多氨多羧型配體與釓配位形成核磁共振成像探針,原吡啶環(huán)上的氮原子則進(jìn)一步與Fe2+配位自組裝。Verwilst等[14]在1,10-鄰二氮雜菲-5-苯胺的胺基端接上DOTA類釓配合物,原鄰二氮菲上的氮原子與Ru3+配位,Dehaen等[15]在通過酰胺反應(yīng)將DTPA類釓造影劑接于3,4-(二芐氧基)苯乙胺上的胺基端以及芐氧基脫保護(hù)后直接與Ti4+配位,均得到雙模式造影劑。Gong[16]、Bourlinos[17]等以碳量子點(diǎn)作為熒光部分,同樣獲得了雙模式造影劑。本課題組最近將碳量子點(diǎn)與含有雙季銨鹽基團(tuán)的配合物通過靜電自組裝方式獲得了生物相容性良好的雙模式造影劑[18]。當(dāng)前多數(shù)雙模式造影劑都是基于DOTA或DTPA及其衍生物的釓配合物作為核磁共振成像探針,且所得到的造影劑的熒光量子產(chǎn)率不高,在提高造影劑靈敏性方面提升較小,在后續(xù)的生物體內(nèi)研究中仍然有所限制。

針對以上情況,本文以6-羧基熒光素作為熒光探針,以三(2-氨基乙基)胺(TREN)作為新的釓配體應(yīng)用于雙模式造影劑的制備,合成出多胺多羧型配體,再與六水合氯化釓配位得到相應(yīng)的順磁性釓(Ⅲ)配合物,將核磁共振成像和光學(xué)成像有效結(jié)合成一種雙模式核磁共振成像造影劑,使其既具有MRI的高空間分辨率和深層組織穿透力,又具有很高的熒光量子產(chǎn)率,以應(yīng)用于高靈敏度光學(xué)成像。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑和儀器

1,4-二氧六環(huán)、間苯二酚、氫氧化鈉、乙腈、碳酸鉀、N,N-二甲基甲酰胺(DMF),上海凌峰化學(xué)試劑有限公司,分析純;1,2,4-偏苯三甲酸酐,Alfa Aesar公司,分析純;三(2-氨基乙基)胺,Alfa Aesar公司,純度97%;甲基磺酸、鹽酸、硅膠、乙醚,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純;N,N-二異丙基乙胺、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC),上海達(dá)瑞精細(xì)化學(xué)品有限公司,分析純;二碳酸二叔丁酯((Boc)2O)、溴乙酸芐酯、三氟乙酸、1-羥基苯并三唑(HOBt),安耐吉化學(xué),純度98%;二氯甲烷、甲醇、正己烷,蘇州晶協(xié)高新電子材料有限公司,分析純;氫化鈣,上海天蓮精細(xì)化工有限公司,純度≥96%;氘代氯仿(CDCl3)、氘代二甲基亞砜(DMSO-d6)、重水(D2O)、氘氧化鈉(NaOD),J&K化學(xué)有限公司,分析純。6-羧基熒光素合成參考文獻(xiàn)[19]。

核磁共振氫譜(1H-NMR)、碳譜(13C-NMR):美國Bruker公司Ultra Shield 400 spectrometer核磁共振儀;質(zhì)譜(MS):英國質(zhì)譜公司Micromass LCTTM液相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀,電噴霧電離(ESI)方式;等離子吸收光譜(ICP-AES):采用等離子體發(fā)射光譜(IRIS 1000,Varian 710ES)測定Gd(III)含量;核磁共振成像T1測試:通過1.5T的GE核磁共振成像儀(GE Signa Excite 1.5T,GE Medical Systems,USA)進(jìn)行測定;紫外可見(UV-Vis)熒光波譜:采用Fluorolog-3-p 分光光譜儀,激發(fā)和發(fā)射光譜的狹縫都是3 nm。樣品制備:配置一定濃度的溶液樣品,置于石英比色皿用于測試。

1.2 釓(III)配合物的合成

圖1示出了雙模式照影劑釓(III)配合物7的合成路線。

圖1 雙模式造影劑釓(III)配合物7的合成路線Fig.1 Synthesis of dual modal contrast agent Gd (III) complexes 7

配合物7的合成:取配體6(120 mg,0.16 mmol)溶于超純水(100 mL),溶液呈黃綠色,于三頸燒瓶內(nèi)50 ℃下回流攪拌,并用0.5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH至6.5左右。另外將六水合氯化釓(75 mg,0.20 mmol)溶于超純水(5 mL),用注射器緩慢加入該反應(yīng)體系,共計(jì)2 d。期間用0.5 mol/L NaOH溶液不斷調(diào)pH,保持體系的pH在6.5左右,注射完后攪拌反應(yīng)3 d。反應(yīng)完畢,用4 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至9,過濾除去不溶物,濾液旋干得到釓配合物7(0.134 g,產(chǎn)率92%)。

2 結(jié)果與討論

2.1 釓配合物的合成

圖2顯示了化合物2,3和4的核磁氫譜圖。三(2-氨基乙基)胺(TREN)中的伯胺通過碳酸二叔丁酯單保護(hù)后得到化合物2,在化學(xué)位移1.36處可以清楚地看到叔丁基的信號峰,2.30～3.20間的多重峰為乙基胺上氫的信號峰。在此反應(yīng)的后處理中,用二氯甲烷/水體系分液萃取能除去TREN和副產(chǎn)物,從而使得提純過程大幅度簡化而得純凈的化合物2。此外,利用蠕動(dòng)泵恒速微量滴加碳酸二叔丁酯至TREN中,也有助于提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率。接下來,采用乙腈為溶劑,碳酸鉀為縛酸劑,將另外兩個(gè)伯胺與過量的溴乙酸芐酯發(fā)生親核取代反應(yīng)后得到化合物3。在化學(xué)位移為7.33處顯示了芐基上苯環(huán)的峰,5.11處為芐基上亞甲基的信號峰,3.59處為叔胺旁邊的亞甲基的信號峰。最后,經(jīng)過三氟乙酸對叔丁基氧羰基脫保護(hù)后獲得化合物4。在核磁氫譜中,位于1.41處的叔丁基的峰完全消失,證明脫保護(hù)的成功。對化合物4的高分辨質(zhì)譜(ESI-MS)分析進(jìn)一步證明了化合物的結(jié)構(gòu)。

6-羧基熒光素與化合物4的酰胺化反應(yīng)是整個(gè)合成路線中重要的一步,該反應(yīng)賦予配體熒光成像的功能。在本實(shí)驗(yàn)中,分別嘗試過以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)/4-二甲氨基吡啶(DMAP),N-羥基丁二酰亞胺(NHS)的NHS/DMAP,EDCI/NHS等組合來活化羧基,但是反應(yīng)均無法順利進(jìn)行。最后以DCC/HOBt來活化6-羧基熒光素,制成活性酯后再加入化合物4,成功得到目標(biāo)化合物。隨后以鈀/碳作為催化劑,在氫氣鼓泡的情況下常壓氫解脫去芐基,通過無水乙醚反沉淀法去除雜質(zhì),得到純凈的配體6。

在配體6與六水合氯化釓的配位反應(yīng)中,隨著反應(yīng)程度的深入,體系中會出現(xiàn)副產(chǎn)物鹽酸,導(dǎo)致配體上氮原子被質(zhì)子化進(jìn)而影響配位效果。為此,需要在配位過程中不斷地用氫氧化鈉中和所產(chǎn)生的鹽酸,同時(shí)需要保證體系的pH不能超過7。如果pH過高的話,釓離子會迅速轉(zhuǎn)變?yōu)闅溲趸彸恋矶绊懙狡渑c配體6的配位效果。等配位反應(yīng)完畢后,提高pH,將多余的氯化釓沉淀后即獲得所需的雙模式造影劑配合物7。該配合物具有良好的水溶性,在室溫下10 mL去離子水中可以溶解0.89 g配合物,對應(yīng)于約0.05 mol/L的溶解度。

圖2 化合物2,3,4的核磁共振氫譜的對比Fig.2 Comparison of 1H-NMR spectra of compound 2,3,4

2.2 釓配合物弛豫率的分析

釓配合物水溶液的縱向弛豫時(shí)間(T1)通過1.5T的GE核磁共振成像儀進(jìn)行測定。將不同濃度的釓配合物溶液置于1.5 mL的塑料離心管,對這些樣品進(jìn)行核磁共振成像后得到圖像。分析其像素與信號的指數(shù)關(guān)系,計(jì)算出樣品中心的平均像素值,并得出相應(yīng)的T1值。再根據(jù)1/T1與釓(Ⅲ)的濃度(c)的線性關(guān)系得到一次函數(shù)關(guān)系圖,擬合直線的斜率即為弛豫率r1。

c與1/T1的線性關(guān)系如圖3所示。由此得到釓配合物的弛豫率r1為3.46 mM-1·s-1,與商用造影劑馬根維顯[23](Gd-DTPA)的弛豫率(3.2 mM-1·s-1)接近。當(dāng)核磁共振成像造影劑的水合常數(shù)為1時(shí),其弛豫率通常在3～4 mM-1·s-1之間,因此配合物7的弛豫率符合這類造影劑的預(yù)期。另外,核磁共振成像結(jié)果顯示隨著釓濃度的增加,成像效果會越來越亮,如圖4所示。

圖3 雙模式造影劑的r1曲線Fig.3 r1 curve of the bimodal contrast agent

圖4 雙模式造影劑的核磁共振成像Fig.4 MR image of the bimodal contrast agent

2.3 釓配合物熒光測試

圖5顯示了配合物7的紫外可見吸收光譜和熒光光譜。在紫外可見光譜中,配合物于490 nm處顯示吸收峰,該吸收峰與6-羧基熒光素的吸收峰相近。選擇460 nm作為激發(fā)波長,對配合物7進(jìn)行熒光光譜掃描,發(fā)現(xiàn)其發(fā)射峰出現(xiàn)在522 nm,與6-羧基熒光素及化合物5,6的熒光發(fā)射峰均很接近,說明配合物7的顏色及熒光主要由熒光素單元貢獻(xiàn)。如圖5內(nèi)插圖所示,在自然光下,釓配合物7的水溶液呈現(xiàn)黃色熒光,當(dāng)其受到365 nm紫外光的激發(fā)時(shí),發(fā)出很強(qiáng)烈的黃綠色熒光。通過與熒光標(biāo)準(zhǔn)化合物(熒光素,79%)對比,配合物7的熒光量子產(chǎn)率的計(jì)算值為66%,其熒光靈敏度超過前述多種雙模式造影劑。

圖5 雙模式造影劑的紫外可見吸收光譜和熒光光譜Fig.5 UV-vis absorption and fluorescence spectra of the bimodal contrast agent

3 結(jié) 論

本文以三(2-氨基乙基)胺(TREN)與6-羧基熒光素為原料設(shè)計(jì)合成出一種新的雙模式核磁共振成像造影劑,將核磁共振成像與光學(xué)成像有效結(jié)合。該造影劑弛豫率為3.46 mM-1·s-1,與商用造影劑馬根維顯(Gd-DTPA)的弛豫率相接近。熒光光譜顯示該配合物的熒光發(fā)射峰出現(xiàn)在522 nm處。在紫外光的激發(fā)下,配合物發(fā)出強(qiáng)的黃綠色熒光。即使將造影劑稀釋數(shù)倍,其仍保留了較高的熒光亮度,為今后在生物體內(nèi)的應(yīng)用打下良好基礎(chǔ)。

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Synthesis of Bimodal Magnetic Resonance Imaging Contrast Agent from Tris(2-aminoethyl)amine and 6-Carboxy-Fluorescein

PAN Fei, ZHU Qin, QIAN Wei-qiao, HU Ai-guo

(Shanghai Key Laboratory of Advanced Polymeric Materials,School of Materials Science and Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

A fluorescent ligand with polydentate amino carboxylate moieties was synthesized from tris(2-aminoethyl)amine and benzyl 2-bromoacetate,followed by the introduction of fluorescent functionality through an amidation reaction between the primary amine group and 6-carboxy-fluorescein.After coordination with paramagnetic GdC13·6H2O,a bimodal contrast agent combing the ability for magnetic resonance imaging (MRI) and optical imaging was formed.The structures of the ligands and the complexes were confirmed by both H- and C-NMR、high resolution mass spectrometry,and ICP-AES.This new MRI contrast agent showed ar1value (longitudinal relaxivity) of 3.46 mM-1·s-1,comparable to commercial small molecular contrast agent like Magevist?(Gd-DTPA).This complex also showed bright green fluorescence when shined with UV light,showing a high quantum yield of 66%,which is essential for clinical bimodal imaging.

magnetic resonance imaging; contrast agent; TREN; fluorescence imaging; quantum yield

1006-3080(2016)06-0758-06

10.14135/j.cnki.1006-3080.2016.06.003

2016-04-01

國家自然科學(xué)基金(21274042)

潘 斐 (1991-),男,江蘇常州人,碩士生,主要從事高分子合成研究。E-mail:irving00@126.com

胡愛國,E-mail:hagmhsn@ecust.edu.cn

O621.3

A