聚陽離子誘導(dǎo)纖維內(nèi)礦化翻開仿生骨修復(fù)的新篇章

牛麗娜，陳吉華，宋 群，楊耀東

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院，陜西 西安 710032)(2.西安交通大學(xué)，陜西 西安710049)

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聚陽離子誘導(dǎo)纖維內(nèi)礦化翻開仿生骨修復(fù)的新篇章

牛麗娜1，陳吉華1，宋 群1，楊耀東2

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院，陜西 西安 710032)(2.西安交通大學(xué)，陜西 西安710049)

近年來，由創(chuàng)傷、腫瘤等因素造成的骨缺損發(fā)生率呈上升趨勢(shì)，給患者帶來了巨大的痛苦。當(dāng)缺損量超出自體修復(fù)能力時(shí)，就需要天然或人工骨替代材料來進(jìn)行修復(fù)。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全世界每年約有220萬的病人需要進(jìn)行骨移植修復(fù)。在眾多骨缺損修復(fù)材料中，自體骨、異體骨是常用的移植材料，但是它們存在來源有限、免疫排斥、病毒傳播等問題，難以滿足臨床需求。另外，異種骨還因抗原性強(qiáng)而應(yīng)用較少。所以，合成結(jié)構(gòu)功能高度仿生的人工骨再生修復(fù)材料是解決這一問題的關(guān)鍵。好的修復(fù)材料應(yīng)當(dāng)盡量“靠近”自然成骨過程，對(duì)破損處進(jìn)行“仿生”修復(fù)。

自然骨組織最主要的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)就是膠原纖維和羥基磷灰石所形成的纖維內(nèi)礦化模式和7級(jí)分級(jí)結(jié)構(gòu)，按照礦物質(zhì)與膠原的相對(duì)位置關(guān)系，這些礦物質(zhì)可分為纖維內(nèi)礦化和纖維間礦化，其中纖維內(nèi)礦化決定了骨組織優(yōu)異的力學(xué)特性和生物學(xué)特征。在構(gòu)建人工骨修復(fù)材料時(shí)，也應(yīng)盡最大可能地模擬天然骨組織的這種纖維內(nèi)礦化的結(jié)構(gòu)形式。所以探索纖維內(nèi)礦化的機(jī)制對(duì)于指導(dǎo)仿生礦化材料的構(gòu)建和生物礦化機(jī)制的揭示具有重要的意義。

在天然骨組織的形成過程中，非膠原蛋白調(diào)控著整個(gè)礦化的進(jìn)程，也成為仿生礦化中仿生的關(guān)鍵一步。這些非膠原蛋白最主要的特征是富含羧基，而呈陰離子特性?；谶@一特性，傳統(tǒng)的仿生礦化機(jī)制認(rèn)為帶負(fù)電的非膠原蛋白(或者非膠原蛋白類似物)穩(wěn)定鈣磷溶液，形成帶負(fù)電荷的礦化前體?；谡?fù)電荷相吸的庫(kù)倫引力理論，帶負(fù)電荷的礦化前體與帶正電荷的膠原位點(diǎn)間相互吸引，成為纖維內(nèi)礦化形成的動(dòng)力。基于這一理論，幾乎所有的體外研究都使用富含羧基的酸性聚合物來模擬非膠原蛋白的功能，并集中于聚陰離子誘導(dǎo)的纖維內(nèi)礦化上。

第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院陳吉華教授和牛麗娜副教授課題組，在前期的研究中，意外的發(fā)現(xiàn)聚陽離子也可以穩(wěn)定鈣磷溶液形成帶正電荷的礦化前體，并能成功誘導(dǎo)帶正電荷的膠原纖維的纖維內(nèi)礦化(如圖1)。這一實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象與傳統(tǒng)的基于庫(kù)倫引力的仿生礦化機(jī)制相左，提示仿生礦化機(jī)制其實(shí)存在其他的可能性。

歷時(shí)3年，牛麗娜課題組使用鼠尾膠原、重組的牛皮膠原、脫礦的牙本質(zhì)膠原、脫礦的骨膠原等不同的膠原模型反復(fù)印證了聚陽離子誘導(dǎo)纖維內(nèi)礦化這一實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。通過膠原改性，發(fā)現(xiàn)在膠原上增加負(fù)電荷，會(huì)抑制聚陽離子誘導(dǎo)的纖維內(nèi)礦化的形成，相反如果膠原上增加正電荷，會(huì)促進(jìn)聚陽離子誘導(dǎo)的纖維內(nèi)礦化的形成(如圖2)。這一實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，動(dòng)搖了傳統(tǒng)的基于庫(kù)倫引力的仿生礦化機(jī)制，顯示原本經(jīng)典的聚陰離子誘導(dǎo)的纖維內(nèi)礦化理論并不全面。

圖2 通過交聯(lián)法在膠原表面節(jié)枝聚陽離子實(shí)現(xiàn)膠原的陽離子改性。(a)改性后膠原表面的氨基數(shù)量顯著增加，而羧基數(shù)量顯著降低(P<0.05)；(b)左圖為陽離子型膠原在聚丙烯氯化銨穩(wěn)定的鈣磷溶液中僅孵育1天即可發(fā)生顯著的纖維內(nèi)礦化，圖中標(biāo)尺=500 nm；右圖為高倍鏡下觀察可見羥基磷灰石晶體在膠原纖維內(nèi)部有序排列，并反映了膠原的橫紋結(jié)構(gòu)，圖中標(biāo)尺=200 nm

課題組使用改良的液相色譜法證實(shí)膠原纖維具有半透膜的性質(zhì)，小于6 KDa的分子可以自由通過膠原纖維的內(nèi)部間隙，大于40 KDa的分子無法進(jìn)入膠原纖維的內(nèi)部間隙。由于礦化系統(tǒng)中所使用的聚電解質(zhì)分子量較大，這些分子會(huì)被部分或者全部排出在膠原纖維之外，同時(shí)由于這些聚電解質(zhì)帶有大量的電荷，勢(shì)必在膠原內(nèi)外環(huán)境間形成Gibbs-Donnan平衡，也就是電荷和滲透壓的雙平衡。

為了印證這一假設(shè)，通過使用計(jì)算機(jī)模擬和液相原子力顯微鏡技術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)膠原纖維處于富含高分子量的聚電解質(zhì)溶液中時(shí)，膠原纖維內(nèi)部的水分流出、膠原收縮、直徑變小，并在膠原內(nèi)部形成彈性回縮力，當(dāng)收縮的膠原處于聚電解質(zhì)穩(wěn)定的鈣磷溶液中時(shí)，會(huì)吸引液態(tài)的礦化前體進(jìn)入膠原內(nèi)部，并在膠原內(nèi)部不同氨基酸殘基的作用下，從無定型態(tài)轉(zhuǎn)化為結(jié)晶態(tài)的磷灰石，形成纖維內(nèi)礦化(如圖3)。這樣的一個(gè)機(jī)制可以總結(jié)為基于滲透壓和電荷平衡的纖維內(nèi)仿生礦化理論。

該成果在生物礦化機(jī)制研究領(lǐng)域中具有里程碑式的意義。聚陽離子誘導(dǎo)纖維內(nèi)礦化現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)不僅打開了仿生礦化材料構(gòu)建這一新領(lǐng)域的大門，擴(kuò)大了非膠原蛋白類似物的范圍，更重要的是顛覆了被認(rèn)為是“圣經(jīng)”的庫(kù)倫引力誘導(dǎo)纖維內(nèi)礦化的理論，表明單純以庫(kù)倫力誘導(dǎo)纖維內(nèi)礦化理論為基礎(chǔ)，試圖通過增加膠原表面正電荷促進(jìn)聚陰離子誘導(dǎo)膠原礦化的方法并不完備。課題組提出并反復(fù)印證的新的礦化理論——基于滲透壓和電荷平衡的礦化，是更加全面的纖維內(nèi)礦化的理論。這一新理論提示我們骨組織生物礦化的研究不應(yīng)該僅僅局限于酸性的非膠原蛋白，大量的堿性蛋白甚至是廣泛存在的蛋白聚糖都有可能影響著生物礦化的進(jìn)程。

圖3 離子型聚合物(以聚陽離子為例)誘導(dǎo)纖維內(nèi)礦化的機(jī)制示意圖。帶正電荷的大分子陽離子聚合物無法進(jìn)入膠原內(nèi)部，在膠原內(nèi)外逐步形成電荷和滲透壓的雙平衡，從而引起膠原內(nèi)水分子外流及無定形磷酸鈣前體的內(nèi)流，進(jìn)入膠原內(nèi)部的無定形磷酸鈣在膠原內(nèi)部不同氨基酸殘基的作用下，從無定型態(tài)轉(zhuǎn)化為結(jié)晶態(tài)的磷灰石，形成纖維內(nèi)礦化

鑒于該研究為生物礦化機(jī)制的探索提供了強(qiáng)有力的理論支撐，拓寬了生物礦化的研究范圍，該成果近日在NatureMaterials以Article形式發(fā)表(DOI:10.1038/nmat4789)。我們相信，基于滲透壓和電荷平衡的纖維內(nèi)仿生礦化理論，將翻開仿生骨修復(fù)的新篇章。

(編輯 蓋少飛)

【編者按】當(dāng)前，由于疾病、意外事故等原因引起的骨損傷、骨缺失的人數(shù)急速攀升。為了緩解和治愈骨組織疾病對(duì)患者機(jī)體造成的痛苦和功能障礙，人們對(duì)骨修復(fù)技術(shù)的依賴性亦日益俱增。目前骨修復(fù)的主要方法有自體骨移植、異體骨移植、人工合成骨移植(仿生骨修復(fù))。其中，自體骨移植來源有限，且會(huì)造成患者病愈后的疼痛，對(duì)其康復(fù)后的行動(dòng)造成一定的限制；異體骨移植雖然來源較前者豐富，但成本高、加工處理復(fù)雜，并且存在免疫排斥、新來源疾病傳播等風(fēng)險(xiǎn)。因此仿生骨修復(fù)技術(shù)成為該類疾病治愈的關(guān)注熱點(diǎn)。近日，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院陳吉華教授和牛麗娜副教授課題組在仿生骨修復(fù)技術(shù)的研究中意外發(fā)現(xiàn)聚陽離子可以穩(wěn)定鈣磷溶液形成帶正電荷的礦化前體，并能成功誘導(dǎo)帶正電荷的膠原纖維的纖維內(nèi)礦化。該發(fā)現(xiàn)顛覆了庫(kù)倫引力誘導(dǎo)纖維內(nèi)礦化的傳統(tǒng)理論，為探索仿生礦化的新機(jī)制提供了可能。目前該成果以Article的形式發(fā)表于NatureMaterials。