哌醋甲酯對ADHD動物模型SHR大鼠前額葉皮質(zhì)層細胞凋亡的影響

閻 櫻，王亞萍

(1.西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，陜西 西安710004，2.西安市中心醫(yī)院兒童保健科，陜西西安710003)

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哌醋甲酯對ADHD動物模型SHR大鼠前額葉皮質(zhì)層細胞凋亡的影響

閻 櫻1,2，王亞萍1

(1.西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，陜西 西安710004，2.西安市中心醫(yī)院兒童保健科，陜西西安710003)

目的 本研究以自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)作為注意缺陷多動障礙(ADHD)動物模型，探討ADHD動物模型SHR大鼠中是否存在前額葉皮質(zhì)層細胞凋亡現(xiàn)象，以及哌醋甲酯能否影響大鼠前額葉皮質(zhì)層細胞的凋亡。方法 將SD大鼠作為對照組，SHR大鼠分為兩組，每組6只，分別為SHR組和哌醋甲酯組。哌醋甲酯組給予哌醋甲酯(2mg/kg)連續(xù)灌胃14天，1次/日，對照組、SHR組給予等體積0.9%氯化鈉注射液連續(xù)灌胃14天，1次/日，取腦，制作石蠟切片，用TUNEL染色觀察前額葉皮質(zhì)層細胞凋亡情況。結(jié)果 SHR組前額葉皮質(zhì)層細胞凋亡率(17.23±0.61%)較對照組(2.74±0.24%)顯著增高(F=-13.902，P<0.05)；哌醋甲酯組前額葉皮質(zhì)層細胞凋亡率(7.82±0.53%)較未經(jīng)藥物干預的SHR組顯著減少(F=8.87，P<0.05)，但仍然高于對照組(F=-9.048，P<0.05)。結(jié)論 ADHD動物模型SHR大鼠前額葉皮質(zhì)層細胞存在凋亡增高現(xiàn)象，哌醋甲酯可以在一定程度上改善ADHD前額葉皮質(zhì)層細胞的凋亡。

注意缺陷多動障礙；哌醋甲酯；大鼠前額葉皮質(zhì)層細胞； 凋亡；原位末端轉(zhuǎn)移酶標記

注意缺陷多動障礙(ADHD)是兒童及青少年常見的神經(jīng)發(fā)育障礙，主要表現(xiàn)為注意力集中困難、活動過度和沖動行為的癥狀。最新的Meta分析顯示其全球發(fā)病率約為3.4%(95%CI:2.6～4.5)[1]。結(jié)構(gòu)像磁共振發(fā)現(xiàn)，ADHD兒童的特定腦區(qū)比正常兒童體積小，包括前額葉、尾狀核、小腦半球和蚓體等[2]。中樞興奮劑哌醋甲酯(methylphenidate，MPH)是ADHD的一線治療藥物，它能明顯提高患者的注意力及改善多動，但其具體治療機制不詳，多數(shù)學者認為其與多種中樞神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)，如多巴胺、5-羥色胺、膽堿等[3]。本研究期望發(fā)現(xiàn)ADHD患兒腦體積的減少是否與前額葉皮質(zhì)層細胞凋亡的因素有關(guān)；還想要了解對于用哌醋甲酯治療有效的患兒，其藥物的主要機制之一是否為減少前額葉皮質(zhì)層細胞凋亡。自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)有很多特點類似臨床上ADHD患者的表現(xiàn)，被認為是迄今最理想的ADHD動物模型。本研究以ADHD動物模型SHR大鼠為研究對象，探討ADHD的發(fā)病機制是否有前額葉皮質(zhì)層細胞凋亡因素的參與，哌醋甲酯對于ADHD作用機制是否存在影響前額葉皮質(zhì)層細胞凋亡的途徑。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物

三周齡SHR大鼠12只購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司、三周齡SD(Sprague-Dawley)大鼠6只，由西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心提供，雌雄合籠在層流架帶鼠盒內(nèi)飼養(yǎng)(符合SPF標準)。

1.1.2藥品和試劑

0.9%氯化鈉注射液、哌醋甲酯緩釋片購自西安交通大學第二附屬醫(yī)院西藥房。原位末端轉(zhuǎn)移酶標記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling, TUNEL)試劑盒購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1動物實驗過程

將SD大鼠6只作為對照組(A組)，按照隨機分組原則，SHR大鼠分為兩組，每組6只，分別為SHR組(B組)和哌醋甲酯組(C組)。實驗期間C組給予哌醋甲酯(2mg/kg)連續(xù)灌胃14天，1次/日；A、B組給予等體積0.9%氯化鈉注射液連續(xù)灌胃14天，1次/日。整個實驗過程自由飲水、進食，自然晝夜節(jié)律光照。

1.2.2腦標本采集

大鼠麻醉后心臟灌注固定，開顱取腦(前段約4mm作為額葉)，放入10%甲醛溶液中固定，制作石蠟切片，用于TUNEL染色觀察前額葉皮質(zhì)層細胞凋亡情況。

1.2.3 TUNEL技術(shù)檢測大鼠前額葉皮質(zhì)層細胞凋亡

按照試劑盒說明書進行脫蠟、水化、固定、細胞通透、固定、平衡、制備TUNEL反應混合液、標記反應、終止反應、封閉POD、酶標反應、DAB顯色(避光)、用蘇木素復染、中性樹膠封片等步驟后，倒置顯微鏡下觀察前額葉皮質(zhì)層細胞TUNEL的陽性表達并照相。

1.2.4凋亡細胞計數(shù)

光鏡下觀察，選擇切片中最有代表性的視野，每張切片連續(xù)隨機觀察5個非重疊視野(10×10)，采用Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)進行陽性細胞計數(shù)，計算陽性率=陽性細胞數(shù)/觀察細胞數(shù)×100%。

1.3統(tǒng)計學方法

對于連續(xù)性的變量，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，使用單因素方差分析進行組間差異比較，檢驗結(jié)果以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

對照組前額葉皮質(zhì)鏡下偶見陽性反應細胞，較多表現(xiàn)為核著色淺藍，細胞疏散且界限較為不清的TUNEL陰性細胞(見圖1A)，陽性率2.74±0.24%(見表1、圖2)。SHR組可見大量TUNEL陽性反應細胞即凋亡細胞，胞核固縮濃染，呈深褐色，胞體縮小，形狀不規(guī)則(見圖1B)，陽性率17.23±0.61%(見表1、圖2)。與對照組相比，前額葉皮質(zhì)層凋亡細胞陽性率顯著增高，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見表1、圖2。哌醋甲酯組光鏡下可見少量凋亡細胞(見圖 1C)。陽性率7.82±0.53%，見表1，圖2。與SHR組相比，凋亡細胞陽性率顯著降低(P<0.05)，但仍然高于正常對照組(P<0.05)，見表1、圖2。

組別樣本數(shù)(只)凋亡細胞率對照組6(2．74±0．24)SHR組6(17．23±0．61)ac哌醋甲酯組6(7．82±0．53)bcF123．73P0．00

注：SHR組vs對照組，F(xiàn)=-13.902，aP<0.05；哌醋甲酯組vs對照組，F(xiàn)=-9.048，bP<0.05；哌醋甲酯組vs SHR組，F(xiàn)=8.87，cP<0.05。

注：A表示對照組；B表示SHR組；C表示哌醋甲酯組。

圖1 TUNEL技術(shù)檢測各組大鼠前額葉皮質(zhì)層凋亡細胞(100倍)。

Fig.1 PFC cells apoptosis of rats detected by TUNEL in different groups (100 fold)

注：**表示組間有顯著性差異，P<0.05。

圖 2 各組大鼠前額葉皮質(zhì)層細胞凋亡率比較

Fig.2 Comparison of apoptosis rate of PFC cells of rats among different groups

3討論

3.1注意缺陷多動障礙的發(fā)病機制的研究現(xiàn)況

注意缺陷多動障礙(ADHD)是兒童最常見的心理行為疾患之一，患病率通常為3%～5%，男女發(fā)病比例為2～9:1?；純和ǔ＞哂腥缦屡R床特征：注意力易分散且與年齡不相稱，注意廣度縮小，不分場合的過度活動以及情緒沖動等；常合并有其他行為問題，如學習障礙、品行障礙、情緒障礙、抽動障礙等。

近年來兒童ADHD發(fā)病率有逐漸上升趨勢，但其發(fā)病機制仍不清楚。目前多認為ADHD是一種多因子參與的復雜疾病，其中遺傳因素、神經(jīng)影像學改變、家庭社會環(huán)境因素以及環(huán)境毒素等備受關(guān)注[4]。首先在遺傳因素方面，這些候選基因主要集中在多巴胺能通路、5-羥色胺相關(guān)通路以及去甲腎上腺能通路的相關(guān)基因。而多巴胺能系統(tǒng)因其在運動控制、認知功能中有重要作用而受到廣泛關(guān)注。在比較熱點的多巴胺能通路候選基因中DRD4及DAT1是研究最廣泛的 ADHD候選基因。其次，近年來隨著影像學的發(fā)展，尤其是功能核磁共振的出現(xiàn)和發(fā)展，發(fā)現(xiàn)ADHD兒童腦結(jié)構(gòu)及功能存在異常改變，這為ADHD是一種兒童神經(jīng)發(fā)育異常性疾病提供了客觀可靠的依據(jù)，同時這些改變在ADHD的發(fā)病機制中起著至關(guān)重要的作用。在功能磁共振成像(fMRI)的研究中發(fā)現(xiàn)左側(cè)下前額葉皮質(zhì)/島葉，腦及左側(cè)頂下小葉皮質(zhì)活動下降被認為與ADHD患兒較差的時間控制相關(guān)[5]。還有研究表明在撫養(yǎng)機構(gòu)成長兒童中，其ADHD 發(fā)病率高于社區(qū)撫養(yǎng)兒童，且撫養(yǎng)機構(gòu)撫養(yǎng)的兒童與社區(qū)撫養(yǎng)的兒童相比存在廣泛的大腦皮層厚度減少(包括前額葉、頂葉及顳葉)，表明大腦皮層厚度的減少可以解釋撫養(yǎng)機構(gòu)撫養(yǎng)兒童ADHD癥狀明顯增高的原因[6]。這種現(xiàn)象與兒童后期和青少年階段的ADHD患者顯示出皮層厚度的發(fā)育遲緩程度與癥狀的嚴重性顯著相關(guān)有一致性存在，而這種異?？赡苁堑蛲鱿嚓P(guān)基因及蛋白高表達的因素導致。

3.2前額葉皮質(zhì)層細胞凋亡也許參與了注意缺陷多動障礙的發(fā)病機制

隨著影像學的發(fā)展，可以為ADHD的發(fā)病機理提供新證據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)ADHD兒童異常的腦區(qū)主要位于前額葉、枕葉、小腦。例如對ADHD兒童腦結(jié)構(gòu)的磁共振成像研究中發(fā)現(xiàn)，ADHD兒童的右前額葉、右紋狀體、左頂葉的體積減小，而右枕葉的體積增大，左后外側(cè)腦室擴張。已明確額葉紋狀體回路在運動及注意力控制中起著重要作用。有研究在任務態(tài)fMRI常發(fā)現(xiàn)ADHD患兒的額葉及額紋狀體區(qū)存在活動減退(血流量下降)的腦區(qū)，如初級運動皮層與雙側(cè)額下回、右側(cè)緣上回、角腦回、杏仁核、豆狀核、蒼白球之間的功能聯(lián)系活動減少，從而提示ADHD患兒在運動通路中存在損害[4]。還有研究提示ADHD組前額葉扣帶回功能減弱，所以不能有效的監(jiān)控目標，從而導致ADHD患者意識活動無法輕松自如地持續(xù)快速地連續(xù)運行，使得注意力分散和多動。也有研究發(fā)現(xiàn)雙側(cè)前額葉間連接強度高，使神經(jīng)纖維的傳遞不能有序進行，皮層活動有效性降低，從而表現(xiàn)出注意力障礙等[7]。上述研究均提示ADHD的發(fā)病機制與前額葉的結(jié)構(gòu)功能異常密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示SHR大鼠的前額葉皮質(zhì)層凋亡細胞陽性率明顯高于對照組大鼠。另外，動物模型的行為學研究發(fā)現(xiàn)，SHR大鼠與對照組大鼠之間存在記憶能力的差別，SHR大鼠表現(xiàn)出明顯的記憶障礙，而學習能力無顯著差異[8]。前額葉皮質(zhì)是與記憶密切相關(guān)的腦部結(jié)構(gòu)，它是負責工作記憶的重要腦區(qū)。有研究發(fā)現(xiàn)額葉兩側(cè)功能連接強度增加，使短暫記憶過程繁復，記憶時間延長，故ADHD兒童常表現(xiàn)工作記憶障礙[7]。因此認為ADHD的記憶障礙可能與前額葉皮質(zhì)層細胞的凋亡有關(guān)。

3.3哌醋甲酯改善ADHD的學習記憶可能與影響腦細胞凋亡的途徑有關(guān)

臨床上哌醋甲酯是治療ADHD的常用藥，動物行為學研究發(fā)現(xiàn)，哌醋甲酯能明顯改善SHR大鼠多動、沖動行為及記憶障礙，表現(xiàn)為在Morris水迷宮空間探索實驗中接受哌醋甲酯干預的大鼠在原平臺象限停留時間的百分比增加且穿越原平臺的次數(shù)也增多。另有研究顯示它對課堂學習任務的完成及社會功能均有正性的作用。還有影像顯示中樞興奮性藥物能夠使ADHD患者皮層及皮層下組織，丘腦及白質(zhì)發(fā)育向正?；l(fā)展。本研究結(jié)果顯示哌醋甲酯干預的SHR大鼠前額葉皮質(zhì)層凋亡細胞較未經(jīng)藥物干預的SHR大鼠顯著降低，表明精神興奮藥促使腦向正?；l(fā)展，說明哌醋甲酯改善ADHD的臨床癥狀(尤其是發(fā)病機制不明的學習記憶方面)可能存在前額葉皮質(zhì)層細胞凋亡途徑的參與。這可能對于治療ADHD新藥的研發(fā)提供新的方向。

總之，ADHD患者腦結(jié)構(gòu)異常、發(fā)育障礙以及癥狀的存在可能與前額葉皮質(zhì)層細胞凋亡有關(guān)，哌醋甲酯促使腦向正?；l(fā)展，改善ADHD臨床癥狀可能通過影響前額葉皮質(zhì)層細胞凋亡的途徑。我們的研究首次從細胞凋亡方面對ADHD 發(fā)病機制進行闡明，這是本課題的創(chuàng)新之處，然而哌醋甲酯影響凋亡通路的具體機制還需要進一步研究探討。

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[專業(yè)責任編輯：帖利軍]

Effect of methylphenidate on prefrontal cortex (PFC) cells apoptosis in SHR of ADHD model

YAN Ying1,2, WANG Ya-ping1

(1.SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710004,China;2.DepartmentofChildHealthcare,Xi’anCentralHospital,ShaanxiXi’an710003,China)

Objective To investigate whether apoptosis of prefrontal cortex (PFC) cells exists in spontaneous hypertension rat (SHR) taken as animal model of attention deficit hyperactive disorder (ADHD) and the effect of methylphenidate on PFC cells apoptosis in SHR. Methods SD rats were used as control group, and 12 SHRs were equally divided into two groups including SHR group and methylphenidate group. Methylphenidate group was fed with methylphenidate (2mg/kg) once a day for 14 days. Control and SHR groups were fed with the same volume of 0.9%NaCl once a day for 14 days. Brain tissue was made into paraffin sections, and apoptosis of PFC cells was detected by TUNEL staining. Results The apoptosis rate of PFC cells in SHR group (17.23±0.61%) was significantly higher than that in the control group (2.74±0.24%) (F=-13.902,P<0.05). The apoptosis rate of PFC cells in methylphenidate group (7.82±0.53%) was greatly lower than SHR group without intervention (F=8.87,P<0.05), but it was higher than that in the control group (F=-9.048,P<0.05). Conclusion Increase of apoptosis of PFC cells appears in SHR rat as animal model of ADHD. Methylphenidate may reduce apoptosis of PFC cells in some degree. This study provides valuable insights for mechanism of ADHD and the action of methylphenidate in treating ADHD.

attention deficit hyperactivity disorder (ADHD); methylphenidate; prefrontal cortex (PFC) cells; apoptosis; terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL)

2016-07-21

閻 櫻(1978-)，女，副主任醫(yī)師，碩士研究生，主要從事兒童保健工作。

王亞萍，教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.12.007

R179

A

1673-5293(2016)12-1450-03