中藥當歸HPLC指紋圖譜研究進展

劉鳳霞 趙芳 孫逸來 車樹理

甘肅中醫(yī)藥大學定西校區(qū) 甘肅定西 743000

中藥當歸HPLC指紋圖譜研究進展

劉鳳霞 趙芳 孫逸來 車樹理

甘肅中醫(yī)藥大學定西校區(qū) 甘肅定西 743000

當歸是常用中藥，制定科學可靠的質量標準意義重大。文中概述了指紋圖譜的概念和中藥當歸及其制劑HPLC指紋圖譜的研究現狀，并對中藥HPLC指紋圖譜研究中存在的問題進行了討論。

中藥; 指紋圖譜; 研究進展

當歸 [Angelica sinensis(Oliv. ) Diels]為傘形科當歸屬植物，根為其藥用部位， 其味甘、辛溫。歸肝、心、脾經[1]。主要活性成分為具有內酯結構的苯酞類、芳香酸及其酯類等揮發(fā)性成分，以及糖類、腦苷類成分等 [2, 3]。當歸具有廣泛的藥理作用，如抗炎、調經止痛、免疫和物質代謝調節(jié)作用，抗血小板聚集及抗血栓、造血與抗貧血、降血壓和保護心血管系統的作用，平喘、利膽保肝、促進細胞增殖的作用，抗菌、抗病毒、抗輻射、抗腫瘤等作用等。臨床上，當歸在常用的中藥復方制劑中出現的頻率很高，可用于治療多種疾病。

長期以來，對中藥品質的評價標準是建立在其指標成分的含量之上的。如果在此種思想指導下進行研究，需要弄清其各種成分的藥理作用，明確構效關系，從而找出一個或兩個被認為是最有效的活性成分作為藥材或復方制劑的指標成分，然后以其含量高低作為中藥質量的判斷準則。然而，中藥化學組分極其復雜，化學成分眾多，一種或兩種活性成分往往不能正確反映中藥的整體療效，按照傳統的研究模式，將每個化學組分與主治功能進行一一對應幾乎是不可能的。為此，中藥材及其制劑的整體分析和質量控制成為必然的發(fā)展趨勢。中藥指紋圖譜這一質量控制模式便順應了這個趨勢，能全面反映所含成分，能夠更加有效地體現中藥成分的整體性，從而更好地評價中藥的質量。目前已成為國際上公認的控制天然藥物質量的有效手段，為實現中藥走向世界提供了有利的質量保證[4,5]。本文就近年來中藥當歸HPLC指紋圖譜研究方面的概況進行綜述和討論。

1 指紋圖譜概述

中藥指紋圖譜是借助于波譜或色譜技術獲得的中藥(主要是植物藥)次生代謝化學成分的光譜圖或色譜圖，是一種綜合的、可量化的鑒別手段[6]。其作用主要是反映具有復雜成分的中藥及其制劑內在質量的均一性和穩(wěn)定性。利用色譜技術進行指紋圖譜分析的中藥材因生長年限，生長環(huán)境的變化而可能產生個體間較為明顯的差異，但個體間必然有群體共有的相似性。所以，作為指紋圖譜應該既具有判斷該藥材真?zhèn)蔚摹肮残浴?，又有能反映不同的產地、不同采收期、不同處理加工工藝的“特性”特征。具有物種的唯一性和個體的相似性，從而能夠從整體上控制中成藥或中草藥的質量[7]。

目前中藥指紋圖譜的建立方法主要有： ①光譜法：紫外光譜法、紅外光譜法、熒光光譜法等; ②色譜法： 薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法、毛細管電泳法等;③其他方法：X射線衍射法、核磁共振法等。普遍意義上的中藥指紋圖譜指的就是色譜中藥指紋圖譜，國家藥品監(jiān)督管理局在《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》中推薦使用色譜中藥指紋圖譜。色譜指紋圖譜中的高效液相色譜(HPLC)是一種具有高靈敏度、高選擇性、高效、快速的分離分析技術。在藥品的質量控制，中藥的成分研究等方面都是重要的分析手段，藥典中鑒別項下越來越多的使用到此方法。它給出的是高分辨率的輪廓圖譜，重現性好、操作相對容易，而且相比于薄層色譜是封閉系統色譜，在線操作外界影響因素小，色譜穩(wěn)定性好，在線檢測設備可選性較大，很適合指紋圖譜的實驗研究和應用。因此，建立中藥色譜指紋圖譜，HPLC方法是優(yōu)先考慮的方法。

2 中藥當歸HPLC指紋圖譜研究

2.1 當歸藥材HPLC指紋圖譜研究

趙健雄[8]等采用HypersilODS柱(4.6mm×250mm,5μm)，KromasilODS保護柱(4.6mm×10mm,5μm)，甲醇-1%醋酸梯度流動相，流速1.0 mL·min -1，柱溫25℃。色譜峰光譜采集范圍：190～400nm；檢測波長：323nm，流動相：甲醇-1%醋酸(40∶60,V/V)，流速0.7 mL·min -1。研究了10個甘肅不同產地當歸、1個云南產當歸及當歸對照藥材樣品甲醇提取部分產當歸及當歸對照藥材樣品甲醇提取部分的指紋圖譜，結果找出了22個共有峰，該方法樣品處理方法簡單，得到的當歸指紋圖譜穩(wěn)定性、重復性好，可以作為當歸極性部分的特征性指紋圖譜。徐魁[9]等以0.3%磷酸（pH3.0）－乙腈為流動相進行梯度洗脫。色譜柱為PhenomenexC18，柱溫30℃，檢測波長290nm，研究了12批不同產地當歸藥材樣品70%甲醇提取液的指紋圖譜，并對不同產地當歸指紋圖譜的相似度進行了分析，共有指紋峰13個，當歸藥材的相似度大于0.9，為提高當歸藥材質量控制標準提供參考。董自波[10]等采用Zorbax300SBC18分析柱，CH3CN-H2O-H3PO4多階梯度洗脫，流速1mmin，檢測波長280nm。結果確定了當歸水提液中共有指紋峰16個，其中三個峰分別為阿魏酸，洋川芎內酯H和洋川芎內酯I。實驗方法簡便、準確、重復性好。王巍[11]等采用色譜柱Shim-packCLC-DOS柱(6.0mm×150mm,5μm)色譜柱，流動相為甲醇-乙腈-磷酸三乙胺水溶液(3∶12∶85);檢測波長313nm;柱溫40℃;流以阿魏酸為參照，得到17個地區(qū)當歸藥材的指紋圖譜，標定出6個共有峰，同時對含當歸藥材的中成藥建立指紋圖譜，檢出當歸藥材的共有峰。說明所建立的指紋圖譜，對當歸藥材進行質量控制是可行的。張敏[12]等采用PhenomenexLunaC18(250mm×4.6mm,5μm)色譜柱，以水(0.1甲酸)-乙腈作為流動相梯度洗脫，檢測波長254nm，洗脫流速0.5mL/min，記錄時間65min，對13個當歸樣本進行檢測，得到其水溶性成分的HPLC指紋圖，本試驗把HPLC指紋圖譜結合相似度分析和聚類分析用于當歸藥材的質量評價，為當歸藥材水溶性成分的分析提供了一種直觀、簡便的方法，從而為當歸的相關藥效研究、規(guī)范種植等提供了依據。曾彬[13]等分別收集12批川芎、10批當歸藥材，采用LUNA C18色譜柱( 150 mm ×4.6 mm,μm)，流動相為甲醇-1% 冰醋酸，進行梯度洗脫，檢測波長280 nm，流速 1.0 mL·min -1，柱溫35 ℃，以阿魏酸為參照液，分別建立了川芎、當歸藥材水溶性和脂溶性成分的HPLC 指紋圖譜。得到川芎22 個共有峰，當歸9個共有峰，說明川芎和當歸的水溶性化學成分差異較大，可通過指紋圖譜有效區(qū)分。魏剛[14]等采用HPLC法分析指紋圖譜，對當歸及其按傳統煎煮方法制備的煎劑指紋圖譜的相關性進行研究，結果表明，當歸飲片與其煎劑的主要特征峰及其相對比值有較大差別，該研究為當歸、當歸煎劑、含當歸復方煎劑的指紋圖譜研究提供了一定參考。

2.2 當歸制劑及提取物HPLC指紋圖譜研究

黃趙剛[15]等采用DiamonsilC18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)，乙腈-水二元梯度洗脫，流速1.0 mL·min -1，DAD檢測器(λ=203nm)，柱溫為30℃，研究不同批次制備的當歸補血總苷樣品的指紋圖譜，確定了13個共有峰，相對峰面積的RSD在1.6%～4.6%之間。指紋圖譜的穩(wěn)定性較好，能有效體現出對當歸補血總苷鑒別的特征性和專屬性，符合指紋圖譜的要求，可用于當歸補血總苷的質量控制。韓繼紅[16]等采用5%甲醇水為溶劑制備樣品溶液，應用LabAlliance高效液相色譜儀，KromasilC18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱，UV檢測器進行測定。以甲醇-0.4%甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，流速1.0 mL·min -1，檢測波長280nm。通過HPLC特征圖譜比較，分析當歸補血湯劑、配方顆粒、口服液3種不同制劑中特征峰、主要成分和未知成分的差異。結果與湯劑相比，當歸補血配方顆粒和口服液在制劑過程當中，化學成分受到不同程度的損失，可能會對藥效產生影響。

楊英來[17]等采用HPLC和GC對10批當歸藥材的水提醇沉部分、醇提取物部分以及揮發(fā)油部分的指紋圖譜進行研究。用中藥色譜指紋圖譜計算機輔助相似性評價系統軟件對數據進行分析，并對方法進行評價。實驗兼顧了當歸的親水性、親脂性和中等極性部分的化學成分，鑒別了水提醇沉部分的4個成分、醇提物部分的7個成分以及揮發(fā)油部分的3個成分，建立的當歸模式指紋圖譜全面反映當歸藥材中化學成分的分布，為當歸藥材及其制劑質量控制的參考依據。王元清[18]等采用高效液相色譜，條件為伊利特ODS2C18(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱，乙腈-水為流動相，梯度洗脫，柱溫30℃，流速1.0 mL·min -1，檢測波長325nm。建立了11個不同批次的當歸、枳殼經CO2超臨界混合萃取的揮發(fā)油的指紋圖譜，以蒿本內酯峰為參照峰，共標定了13個共有峰，利用化學對照品指認了其中2個色譜峰，該指紋圖譜可鑒別當歸、枳殼經水蒸氣蒸餾法得的揮發(fā)油，為科學評價和有效控制其質量提供實驗依據。

3 結語

綜上所述，中藥當歸的HPLC指紋圖譜的研究多集中在方法的建立上，而針對數據信息處理和圖譜相似性評價的研究相對較少。

目前，中藥指紋圖譜存在以下問題：（1）指紋圖譜的標準化問題。指紋圖譜只有具備良好的穩(wěn)定性和重現性才能保證實用性。這就要求必須先抓原料藥材的質量，如固定產地、固定種植技術、固定品種、固定采收時間和加工方法等，落實藥材種植的GAP，建立藥材生產基地。實驗條件對圖譜的制備影響較，中國藥典附錄僅規(guī)定了HPLC固定相的種類、流動相組分、檢測器類型，而對色譜柱長度、流動相流速、混合流動相各組分比例、檢測器靈敏度、溫度、壓力等未做具體要求，但色譜條件的任何改變，都會導致色譜圖形的改變。（2）譜效結合問題。現在的指紋圖譜基本上反映的都是化學信息，而不是藥效信息，應該加強譜效相關性研究。但中藥譜效關系研究尚處于起步階段，存在眾多問題急需解決，如中藥化學指紋圖譜的整體性評價方法，藥效模型的選擇，以及能準確反映中藥譜效間規(guī)律的數學模型等問題。隨著指紋圖譜研究的不斷深入，最終將解決中藥質量評價的關鍵技術問題，建立成熟的中藥質量評價體系。

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劉鳳霞(1980-)，女，副教授，碩士，主要從事中藥藥效成分分析研究.