羊痘的診斷與疫苗研究進展

李 楊，顏新敏，吳國華，李 健，葉奕優(yōu)，趙志荀，朱海霞，張志東，張 強

(1．中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730046; 2．深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518045)

羊痘的診斷與疫苗研究進展

李 楊1，顏新敏1，吳國華1，李 健1，葉奕優(yōu)2，趙志荀1，朱海霞1，張志東1，張 強1

(1．中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730046; 2．深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518045)

羊痘病毒粒子大小約為150 Kbp，分子量約為73～91 MDa。該病毒能引起羊的急性、熱性、接觸性傳染病，因其病毒結(jié)構(gòu)及其發(fā)病癥狀和人類的天花很像，又稱“羊天花”。根據(jù)分離的毒株不同，羊群的發(fā)病率為75%～100%，死亡率在10%～58%。目前沒有特效治療藥，只有通過實驗室診斷和免疫預防來減少疾病的發(fā)生。

1 血清學診斷

瓊脂免疫擴散試驗(AGPT): 早在1963年Bhalnbani和krish就應用同源或異源血清通過瓊脂擴散試驗對羊痘病進行診斷［1］，但是存在羊痘和傳染性膿皰性皮炎(CPD)的抗原交叉反應。1986年對常規(guī)的AGPT做了改進，采用S35蛋氨酸標記抗原，提高了檢測的靈敏度。

對流免疫電泳(CIEP): 1985年建立了對流免疫電泳快速診斷綿羊痘的方法，CIEP在檢測感染組織和細胞中的特異性抗原比AGPT敏感和快速。1999年Rao等［2］設計電泳時用巴比妥緩沖液代替普通的鹽溶液極大地提高了CIEP的敏感性。

熒光抗體技術(shù)(FAT): 1986年Soman等通過FAT對感染羊腎細胞和睪丸細胞的羊痘病毒抗原進行檢測［3］。此方法快速簡單，在抗原感染14～24 h之間就能被檢測到。也能夠檢測到感染動物水皰瘡液、皮膚、LK和LT細胞中的羊痘病毒抗原。

血凝試驗(Hemagglutination Test，HT): 羊痘病毒因?qū)游锛t細胞不產(chǎn)生凝集作用，用致敏的綿羊紅細胞來進行血凝試驗。1989年，Joshi等通過將羊痘抗體連接到葡萄球菌A蛋白(SPA)上，成功的建立了檢測羊痘的協(xié)同凝集試驗。2005年，王開功等［4］采用兔抗山羊痘病毒IgG致敏綿羊紅細胞建立的反向間接血凝試驗，對山羊痘病毒抗原具有特異性和敏感性，對疫區(qū)采集的山羊痘待檢抗原的檢測結(jié)果表明，反向間接血凝法的敏感性比瓊脂免疫擴散試驗高。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA): ELISA是抗原抗體反應與酶促反應相結(jié)合的一種技術(shù)，因其快速、便利、特異性強等特點被應用于羊痘病的診斷。1988年，Sharma等［5］首次將ELISA用于山羊痘病毒的檢測，通過用活的和滅活的抗原與高免血清檢測山羊痘的血清與抗體，但是實驗背景高，且假陽性結(jié)果較高。隨后應用皮膚活檢建立了免疫捕獲ELISA，該方法特異性能達到80%～100%，敏感性能達到70%～86%。1998年，建立了檢測山羊痘病毒的dot-ELISA檢測方法，通過dot-ELISA和CIEP兩種方法對西孟加拉的38個疑似羊痘病毒感染的樣品進行檢測，結(jié)果顯示dot-ELISA方法能檢出28份陽性，檢出率為68.4%，而CIEP能檢出21份陽性，檢出率為55.3%。用已知的陽性樣品作對照，dot-ELISA顯示100%的相關性，CIEP只有80%。dot-ELISA有較高的敏感性和特異性，并能用于野外診斷。2008年吳國華等［6］建立了羊痘病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法，用該方法檢測羊傳染性膿皰病毒和口蹄疫病毒，顯示無交叉反應，具有較高的特異性，與瓊脂擴散試驗對比，其敏感性高4～8倍，可用于對山羊痘病毒和綿羊痘病毒的檢測。

2 分子生物學診斷

基于臨床癥狀和血清學的診斷并不總是可靠的，所以為了克服這些限制，簡單、快速、特異地PCR技術(shù)成為檢測羊痘病毒并區(qū)分LSDV的有效手段。根據(jù)羊痘病毒的衣殼蛋白P32基因序列設計了相應的引物，分別建立了檢測羊痘的PCR方法，成功的從樣品中擴增出目的條帶。Markoulatos針對SPPV的ITR和α微管蛋白基因設計2對引物，建立了用于檢測皮膚組織中SPPV的多重PCR技術(shù)，該方法敏感性和特異性較好，24 h內(nèi)就可作出檢測，但偶爾會出現(xiàn)假陰性結(jié)果。Hosamani根據(jù)山羊痘病毒和綿羊痘病毒P32基因序列的差異，建立了區(qū)分GTPV和SPPV的聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)(PCR-RFLP)。2010年，Lamien根據(jù)G蛋白偶聯(lián)趨化因子受體基因建立了q-PCR方法，該方法使用雙雜交探針，根據(jù)熒光溶解曲線，可以種屬鑒別及基因分型。2008年，韓若嬋等［7］根據(jù)P32基因和末端反向重復序列基因片段設2對引物，建立多重PCR檢測方法，用此方法檢測口蹄疫病毒和羊口瘡病毒，結(jié)果均為陰性。2014年，趙志荀等［8］基于羊痘病毒的保守序列ITR設計三套引物，建立了區(qū)分綿羊痘和山羊痘的環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(LAMP)，并對48份綿羊痘感染樣品和87份山羊痘感染樣品進行檢測，檢出率分別為100%和98.8%。

3 疫苗及免疫

3.1 血清接種 用發(fā)病并恢復健康的羊的血清或者抗羊痘病毒的血清接種羊，但是，其溫和的保護和血清免疫的失敗、致敏淋巴細胞，使之不能作為長期有效的免疫方法。

3.2 弱毒疫苗 1957年，我國袁慶志等［9］等通過將綿羊痘病毒在綿羊與雞胚之間交替?zhèn)鞔共《径玖p弱，并保持了良好的免疫原性。目前我國使用最多的仍然是沈榮顯分離的山羊痘病毒太原株經(jīng)雞胚減毒后的弱毒疫苗，命名為AV41疫苗株，該疫苗免疫動物后免疫持續(xù)期能到1年左右，既能抵抗山羊痘病毒感染又能抵抗綿羊痘病毒感染。印度研制的經(jīng)Vero細胞致弱的山羊痘病毒的活疫苗，接種102.5 TCID50的劑量，能提供4～6月齡的山羊52個月的保護［10］?？夏醽喚d羊山羊0240株是在自然條件下，同一個屬的病毒出現(xiàn)重組并分離得到的，此疫苗株能夠很好保護綿羊和山羊，在非洲的一些國家用于綿羊和山羊的接種免疫。但是弱毒疫苗存在免疫動物后毒力返強和散毒的風險，因此非常有必要研制出更加安全有效的疫苗。

3.3 多肽疫苗 綿羊痘病毒的VP3蛋白被證明是免疫性蛋白，并且在兔體內(nèi)能引起高水平的體液免疫和細胞免疫［11］。用弗氏不完全佐劑乳化的VP3蛋白免疫羊可誘導產(chǎn)生1∶256滴度的血清抗體，對免疫 VP3后接種病毒21 d的羊提供67%的保護［12］。羊痘病毒的另一種結(jié)構(gòu)蛋白－P32蛋白，是近些年的研究熱點，它有很好的免疫原性，能夠誘導中和抗體的產(chǎn)生，但是由于P32蛋白表達量低并且不穩(wěn)定，這在一定程度上制約著此方法的應用前景。因此，找到另一種免疫原性更好，表達量、穩(wěn)定性更好的基因勢在必行。

3.4 活載體疫苗 隨著分子技術(shù)的發(fā)展，以羊痘病毒作為活載體的研究取得了一些進展。羊痘病毒作為活載體有很多優(yōu)點，其基因組結(jié)構(gòu)明確，穩(wěn)定性強，基因組容量大，可容納至少25 Kb的外源基因而不失去感染力，有多個復制非必需區(qū)，對外源基因的插入耐受性強。羊痘病毒宿主范圍窄，只感染羊，對其他動物安全性高，并且能引起強烈的細胞免疫。Romero等［13］構(gòu)建的牛瘟病毒H基因的重組山羊痘病毒，動物試驗顯示，體內(nèi)存在滴度較高的山羊痘病毒中和抗體和牛瘟病毒中和抗體。另外，Wade-Evans等［14］構(gòu)建表達了藍舌病VP7基因的重組羊痘病毒。Aspdcn等［15］構(gòu)建表達狂犬病病毒糖蛋白的重組羊痘病毒，作為復制缺陷型疫苗。Berhe等［16］構(gòu)建表達小反芻獸疫病毒F基因的重組羊痘病毒都有很好的效果。

4 討論

目前我國研究羊痘病毒的實驗室已經(jīng)研發(fā)出多個可以用于羊痘病毒診斷的分子和血清學診斷方法，但是各種原因，目前國內(nèi)尚沒有商品化的診斷試劑盒問世，所以推動羊痘病毒診斷的標準化勢在必行。

隨著分子生物學的迅猛發(fā)展，目前對羊痘病毒基因的理解也更加深入。羊痘病毒毒力基因、宿主范圍基因和宿主之間的關系等基礎研究的深入，為研發(fā)新的檢測方法和疫苗提供了依據(jù)。另外，羊痘病毒作為活病毒載體有著眾多優(yōu)點，研發(fā)羊痘病毒活載體為基礎的多價疫苗是今后一個重要的研究方向。

由于羊痘目前僅在亞洲和非洲發(fā)展中國家和落后國家大規(guī)模流行，歐洲早已消滅了羊痘病毒，因此發(fā)達國家對羊痘的研究較少。羊痘病毒的免疫和致病機制的研究幾乎是空白，因此，要加強和推動羊痘病毒的基礎研究，為羊痘的診斷、疫苗的研發(fā)和疾病的控制奠定基礎。

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S852.65+4

A

0529-6005(2017)06-0086-03

2016-07-19

國家重點研發(fā)計劃課題(2016YFD0500907);甘肅省國際科技合作專項(1604WKCA012);甘肅省國際科技合作專項(1504WKCA055)

李楊(1990-)，男，碩士生，研究方向為分子免疫與環(huán)境控制，E-mail:843290952@qq．com

顏新敏，E-mail:qzhang1616@sohu．com;張強，E-mail: qzhang1616@sohu．com