三七治療局灶性缺血性腦梗死模型小鼠的療效及機(jī)制

王改鳳 張社峰 王偉民

(河南省中醫(yī)院腦病科，河南 鄭州 450000)

三七治療局灶性缺血性腦梗死模型小鼠的療效及機(jī)制

王改鳳 張社峰 王偉民

(河南省中醫(yī)院腦病科，河南 鄭州 450000)

目的觀察三七對(duì)腦梗死模型小鼠的影響，探討作用機(jī)制。方法將50只SD小鼠隨機(jī)分成正常組、模型組、三七高劑量組、三七低劑量組和西藥組。通過(guò)線栓法構(gòu)建小鼠腦梗死模型。成模后，治療組開(kāi)始三七溶液灌胃給藥12 w。N 組和 CT 組給予等體積的生理鹽水溶液。給藥結(jié)束后觀察空腹血糖、肝、腎臟器系數(shù)、血清中白細(xì)胞介素(IL)-18、腫瘤壞死因子(TNF)-α以及腦組織中超氧化酶歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)等相關(guān)指標(biāo)的含量，并通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)檢測(cè)Bcl-2、Bax mRNA水平。結(jié)果三七高劑量組及西藥組空腹血糖比模型組有顯著下降，而且三七治療組及西藥組均可升高Bcl-2的表達(dá)、下調(diào)Bax mRNA的表達(dá)(P<0.05,P<0.01)。結(jié)論三七可能通過(guò)升高Bcl-2的表達(dá)、下調(diào)Bax mRNA的表達(dá)，從而減輕局灶性缺血性小鼠腦梗死。

三七；局灶性缺血性腦梗死；Bcl-2

在缺血性腦梗死的病理機(jī)制中，炎癥氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的腦損傷作用非常明顯〔1，2〕。然而，到目前為止醫(yī)療科學(xué)界對(duì)局灶性缺血腦梗死還沒(méi)有高效無(wú)害的治療措施。本研究采用局灶性缺血性腦梗死模型小鼠觀察三七的療效及其對(duì)Bcl-2及Bax基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 三七(西安天瑞有限公司);Trizol (生工生物技術(shù)有限公司)；Bcl-2及Bax 引物 (生工生物科技有限公司)；血糖試劑盒，南京建成生物工程研究所，白細(xì)胞介素(IL)-18、腫瘤壞死因子(TNF)-α 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)。酶標(biāo)儀，北京瑞利分析儀器公司。PCR儀(Thermo賽默飛世爾科技公司,美國(guó))；電子天平，上海精天電子儀器有公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)C57/BL小鼠50只,體重22～25 g。將小鼠用水合氯醛麻醉后造模:小鼠麻醉后仰臥位固定，由小鼠的頸正中切口，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，隨后結(jié)扎并分離頸外動(dòng)脈主干，在頸外動(dòng)脈游離段上剪開(kāi)一小口，將預(yù)先制備好的尼龍線栓子插入，經(jīng)頸總動(dòng)脈分支處通過(guò)頸內(nèi)動(dòng)脈入顱，至大腦前動(dòng)脈首端，尼龍線插入深度平均為(18.5±0.5)mm，保持30 min。成模標(biāo)準(zhǔn)：左側(cè)肢體疼痛回縮遲鈍或消失；倒懸時(shí)左上肢向胸前屈曲；行走時(shí)身體向左側(cè)傾倒或向左轉(zhuǎn)圈；右側(cè)出現(xiàn)Honer征。隨后將成模小鼠隨機(jī)分為模型組與三七高、低劑量給藥組、西藥組各10只。均飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物房中，自由飲用純凈水。給藥方法:三七高、低劑量組中，每只小鼠分別按150、75 mg·kg-1·d-1灌胃三七溶液，西藥組給予阿司匹林混懸液15 mg·kg-1·d-1。模型組和正常組均灌服等體積生理鹽水,連續(xù)10 w。

1.3腦組織含水量測(cè)定 用10%水合氯醛麻醉小鼠，固定小鼠頭部，去除額極，取病變的腦組織用于腦含水量測(cè)定。(1)將腦組織取出后立即稱重，即得濕重M1；(2)將腦組織放入95℃烤箱內(nèi)烘24 h后取出稱重，即得干重M2；(3)含水量即(M1-M2)/M1×100%。

1.4血清IL-18、TNF-α水平檢測(cè) 小鼠禁食12 h，用10%水合氯醛麻醉小鼠后，眼底靜脈叢取血后，室溫靜置30 min,分離血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IL-18、TNF-α水平。

1.5腦組織中超氧化酶歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)的含量 用10%水合氯醛麻醉小鼠，固定小鼠頭部，去除額極，后取病變的腦組織,加入適量PBS勻漿后，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行SOD、CAT水平檢測(cè)。

1.6實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng) 將腦組織加入Trizol中勻漿，每1 ml Trizol 加入 0.2 ml三氯甲烷；劇烈混合30 s后， 4℃ 12 000 r/min離心10 min，將水相層液體小心轉(zhuǎn)移至新的離心管中；然后加入 0.5 ml異丙醇，混合均勻，室溫靜置10 min；隨后4℃，12 000 r/min離心10 min，可見(jiàn)少量RNA沉淀；吸棄上清溶液，用75%乙醇洗滌沉淀2次；4℃ 7 500 r/min離心沉淀5 min，棄上清，空氣中干燥 RNA 沉淀，用DEPC 水溶解 RNA 沉淀；取2 μl溶解后的RNA，用紫外分光光度法測(cè)定RNA純度及濃度；計(jì)算總RNA濃度。將溶解后的RNA按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增。引物：Bcl-2前向：5'GGGGCTACGAGTGGGATGCTGGAGA3',反向：5'Reverse primer TGCACAGCGGGCATTGGGTTG3';Bax前向：5'Forward primer TGGTTGCCCTCTTCTACTTTGC3'反向：5'Reverse primer CCAGTGTCCAGCCCATGATG3',β-actin反向：5'CTGAACCCTAAGGCCAACCGTGAAA3'反向5'TGAAGCTGTAGCCACGCTCGGTC3'，擴(kuò)增條件：95℃，2 min；95℃，5 s，60℃，32 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS10.0軟件。多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1三七對(duì)局灶性缺血性腦梗死小鼠空腹血糖的影響 與正常組(6.8 mmol/L)相比，模型組小鼠空腹血糖(12.3 mmol/L)明顯增高(P<0.01)。三七高、低劑量給藥組(7.5、8.1 mmol/L)，西藥組(5.8 mmol/L)小鼠與模型組比較空腹血糖明顯下降,且三七高劑量組及西藥組小鼠血糖下降更明顯(P<0.01 或P<0.05)。

2.2三七對(duì)局灶性缺血性腦梗死小鼠肝、腎臟器系數(shù)的影響 與正常組(4.2)相比，模型組小鼠肝臟系數(shù)(3.9)有所下降(P<0.05)。三七高、低劑量給藥組(3.8、3.8)、西藥組(3.9)小鼠與模型組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)，提示三七及阿司匹林對(duì)小鼠無(wú)肝毒性影響。與正常組(5.5)相比，模型組(5.1)小鼠腎系數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)，而且通過(guò)三七低、高劑量(5.1、5.2)、阿司匹林(4.1)給藥后，與模型組比較仍無(wú)顯著差異(P>0.05)，提示三七及阿司匹林對(duì)小鼠無(wú)腎毒性影響。

2.3三七對(duì)局灶性缺血性腦梗死小鼠腦組織含水量的影響 模型組(0.81)小鼠腦組織中含水量較正常組(0.61)明顯增加(P<0.01)，三七高劑量組(0.78)及西藥組(0.68)小鼠腦組織含水量顯著下降(P<0.05)，但三七低劑量組(0.82)與模型組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.4三七對(duì)局灶性缺血性腦梗死小鼠血清IL-1β、TNF-α的影響 模型組血清IL-1β(72)、TNF-α(161)水平較正常組(32、70)明顯上升(P<0.01)，高劑量三七及阿司匹林干預(yù)后能顯著下調(diào)積血清IL-1β(50、48)、TNF-α(109、98)水平(P<0.01或P<0.05)，但三七低劑量組(71、151)與模型組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.5三七對(duì)局灶性缺血性腦梗死小鼠SOD、CAT的影響 與正常組(2.9)相比，模型組(6.0)小鼠CAT水平上升(P<0.01)。三七高劑量組(4.9)及西藥組(5.8)與模型組相比CAT水平下降(P<0.01或P<0.05)，但三七低劑量組(6.1)與模型組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。與正常組(81)相比，模型組(47)小鼠SOD水平下降(P<0.01)。三七高劑量組(59)及西藥組(78)與模型組相比，血清中SOD水平上升(P<0.01或P<0.05)，但三七低劑量組(53)與模型組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.6三七對(duì)局灶性缺血性腦梗死小鼠Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)水平的調(diào)節(jié) 模型組腦組織Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)水平(2.0，1.8)較正常組(0.6，0.5)明顯上升(P<0.01)，三七高、低劑量及阿司匹林干預(yù)后能顯著下調(diào)Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)(0.8，1.4，0.8；0.8，1.2，0.7)，且三七高劑量組下調(diào)作用更顯著(P<0.01或P<0.05)。

3 討 論

腦梗死是由于機(jī)體血管狹窄或閉塞或者血供應(yīng)不足而導(dǎo)致局部腦組織的缺血性壞死。大部分學(xué)者認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制主要是存在損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中主要包括炎癥、凋亡、氧化應(yīng)激等，這些因素相互關(guān)聯(lián)，密不可分，從而形成了一個(gè)緊密聯(lián)系的調(diào)控體系，通過(guò)內(nèi)環(huán)境一系列活動(dòng)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡或者死亡〔3～5〕。在局灶性腦缺血損傷的機(jī)制中，炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)在各項(xiàng)研究中都非?；钴S；其中有大量數(shù)據(jù)表明繼發(fā)性腦損傷后機(jī)體內(nèi)會(huì)釋放大量炎性因子，而這些炎癥因子正是致使血腦屏障損傷的重要因素〔6〕。

近年有大量研究表明，小鼠體內(nèi)敲除了Bcl-2后，其神經(jīng)元氧化蛋白的水平被顯著上調(diào)，同時(shí)會(huì)發(fā)生各種氧化應(yīng)激反應(yīng)〔7～9〕。這些結(jié)果表明，Bcl-2缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的氧化損傷，使細(xì)胞抗氧化能力下降。三七及阿司匹林可以下調(diào)局灶性缺血性腦梗死小鼠Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)。

炎癥在缺血后的繼發(fā)性損傷中發(fā)揮很大的作用。因此，減輕病患的炎癥損傷是治療腦缺血的重要手段。單核巨噬細(xì)胞被激活后，會(huì)分泌產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，其中包括TNF-α。有實(shí)驗(yàn)表明，TNF-α 被TNF 結(jié)合蛋白抑制劑阻斷后，實(shí)驗(yàn)小鼠的腦梗死體積明顯縮小〔10,11〕。IL-1主要由 Th2 細(xì)胞分泌，其家族主要包括 IL-1α、IL-1Ra、IL-1β等。目前的研究表明其可能是通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)炎性細(xì)胞因子減輕局灶性腦缺血損傷，而且具有明顯的抗炎效果，與腦缺血損傷后神經(jīng)元的修復(fù)過(guò)程密切相關(guān)〔12,13〕。本實(shí)驗(yàn)提示三七治療局灶性缺血性腦梗死小鼠，可能通過(guò)抗炎作用，修復(fù)小鼠腦缺血損傷后的神經(jīng)元。

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河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專項(xiàng)課題(2015zy2023)

王改鳳(1981-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療腦血管病，中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性、感染及錐體外系等疾病的研究。

R743

A

1005-9202(2017)20-4997-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.018

〔2017-01-11修回〕

(編輯 徐 杰)