頭花蓼對幽門螺桿菌感染性胃炎大鼠Gas及SS表達(dá)的影響*

簡 單， 溫麗娜， 孫朝琴， 莫 非*, 李永念*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽 550004； 2.貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院， 貴州 貴陽 550002)

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頭花蓼對幽門螺桿菌感染性胃炎大鼠Gas及SS表達(dá)的影響*

簡 單1**， 溫麗娜2， 孫朝琴1， 莫 非1***, 李永念1***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽 550004； 2.貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院， 貴州 貴陽 550002)

目的： 檢測頭花蓼對幽門螺桿菌(H.pylori)感染SD大鼠胃粘膜胃泌素(Gas)和生長抑素(SS)表達(dá)的影響，探討頭花蓼抗H.pylori感染性胃炎的作用機(jī)制。方法： 42只SD大鼠隨機(jī)分為造模組26只和空白組16只，采用H.pylori標(biāo)準(zhǔn)菌灌胃SD大鼠建立H.pylori慢性胃炎大鼠模型;造模成功后，造模大鼠分為模型組和頭花蓼組，頭花蓼組以1.72 g浸膏/(kg·d)的劑量灌胃給藥，模型組和空白組大鼠灌胃等量生理鹽水，治療2周后處死大鼠，取胃竇黏膜組織，HE染色觀察大鼠胃黏膜組織學(xué)改變；免疫組織化學(xué)染色觀察胃黏膜Gas陽性細(xì)胞和SS陽性細(xì)胞的改變，原位雜交檢測大鼠胃黏膜Gas和SS mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果： 與模型組比較，頭花蓼可明顯改善H.pylori感染大鼠胃黏膜炎癥，病理評分顯著降低(P<0.05)；頭花蓼組大鼠胃黏膜Gas陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，Gas mRNA表達(dá)水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SS陽性細(xì)胞數(shù)量、SS mRNA表達(dá)水平較模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論： 頭花蓼可修復(fù)H.pylori感染慢性胃炎胃黏膜損傷，其機(jī)制可能與改善胃腸激素對胃功能調(diào)節(jié)有關(guān)。

螺桿菌，幽門； 胃炎； 頭花蓼； 胃泌素； 生長抑素

幽門螺桿菌(helicobacterpylori，H.pylori)感染是引起慢性胃炎的常見病因，胃腸肽類激素如胃泌素(gastrin，Gas)、生長抑素(somatostatin，SS)等，其含量的變化與慢性胃炎的病理過程與嚴(yán)重程度密切相關(guān)[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)H.pylori感染慢性胃炎患者存在Gas與SS調(diào)節(jié)失衡的現(xiàn)象[2]，本研究復(fù)制H.pylori感染慢性胃炎大鼠模型，HE染色觀察頭花蓼對H.pylori慢性胃炎的炎癥改善效果，免疫組化和原位雜交技術(shù)觀察頭花蓼(polygonumcapitatum)對H.pylori感染慢性胃炎小鼠胃黏膜Gas、SS的定位、分泌情況及其mRNA的表達(dá)水平，期望從胃腸肽類激素分泌角度探討頭花蓼治療慢性胃炎的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

H.pylori悉尼株SS2000，由中國疾病控制中心傳染病所張建中研究員惠贈，保存于貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院臨床檢驗教研室。頭花蓼浸膏粉，棕色粉末，批號為14196，由浙江眾益藥業(yè)有限公司提供。SPF級SD大鼠，6～8周齡，150～180 g，購買于第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，SCXK(軍)2012-0011。哥倫比亞血瓊脂粉、腦心浸液瓊脂干粉購自O(shè)xoid，萬古霉素、兩性霉素、多黏菌素B、TMP購自Sigma，無菌脫纖維羊血購自南京便診生物科技有限公司，兔抗Gas抗體、兔抗SS抗體購自Bioword，二抗PV-HpR、DAB顯色劑購自北京中杉金橋，GAS、SS原位雜交試劑盒均購自武漢博士德。

1.2 方法

1.2.1H.pylori感染性胃炎大鼠模型 參照文獻(xiàn)[3-4]取42只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，取26只制作H.pylori感染慢性胃炎模型，另取16只作為空白對照組，所有SD大鼠禁食不禁水12 h，5 g/L NaHCO3和消炎痛混合液(使胃黏膜損害加重，更利于H.pylori定植)按體重給予雄鼠1.0 mL/只，雌鼠0.5 mL/只預(yù)處理1次；繼續(xù)禁食不禁水，6 h后給予1×1012cfu/LH.pylori悉尼株SS2000菌液1.5 mL，繼續(xù)禁食禁水4 h后正常喂食，隔天灌胃，共5次?？瞻捉M以等量的無菌腦心浸液肉湯代替，末次灌胃8 周后，禁食禁水24 h。造模大鼠和空白組各取6只SD大鼠處死，按照洛桑會議標(biāo)準(zhǔn)[5]，鑒定模型是否建立成功，大鼠胃黏膜有H.pylori定植且胃黏膜出現(xiàn)慢性炎癥病理學(xué)改變判斷為造模成功。H.pylori造模大鼠分為模型組和頭花蓼組，每組10只。

1.2.2 給藥方法及標(biāo)本處理 成功建模后，按照參考文獻(xiàn)[6-7] ，取頭花蓼臨床劑量[3.49 g/(kg·d)]的3倍，對頭花蓼組大鼠進(jìn)行灌胃，連續(xù)14 d(1次/d)，空白組和模型組大鼠給予等量的無菌生理鹽水。治療結(jié)束后第4周處死所有大鼠，留取大鼠胃竇黏膜組織，行40 g/L中性甲醛固定、酒精脫水、二甲苯透明組織，浸蠟、包埋，制成5 μm的石蠟切片，HE染色或免疫組織化學(xué)染色，光鏡下觀察，并進(jìn)行病理學(xué)評分[7]。另取胃竇黏膜進(jìn)行4%多聚甲醛/0.1 mol/L PBS(pH7.0～7.6)固定，固定4 h后，進(jìn)行常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。切片厚度為8 μm，用于原位雜交檢測。

1.2.3 Gas陽性細(xì)胞與SS陽性細(xì)胞 取出SD大鼠胃黏膜組織，40 g/L中性甲醛固定，SD大鼠胃黏膜組織制成石蠟切片，通過脫蠟，抗原修復(fù)，3% H2O2溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清37 ℃孵育封閉20 min，分別滴加兔抗鼠GAS抗體(1∶100)和SS抗體(1∶100)50 μL，濕盒，4 ℃過夜，次日取出至室溫，PBS沖洗，滴加山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體1 d，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌，DAB顯色5～10 min，顯微鏡下控制曝光程度，蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復(fù)染10 s，脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，每張切片觀察5個視野，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均值。采用圖像分析軟件Image-Pro Plus計算陽性顆?；叶戎?。

1.2.4 Gas mRNA、SS mRNA表達(dá) 采用武漢博士德原位雜交試劑盒(內(nèi)含針對大鼠GAS、SS的特異性寡核苷酸探針，經(jīng)地高辛標(biāo)記)。針對Gas、SS靶基因的mRNA探針序列(Gas：Forward primer 5′-3′ACCTTCTCGGAAGCTTCTTGGAAACCTCGCTCCC

A, Reverse primer 5′-3′GAAGCATACGGATGGATGGACTTTGGTCGCCGTA；SS：Forward primer 5′-3′TACTTCTTGGCAGAGCTGCTGTCTGAACCC,Reverse primer 5′-3′AAGAATTTCTTCTGGAAGACTTTCACATC

C)，按照原位雜交試劑盒進(jìn)行操作。顯微鏡下觀察，采用圖像分析軟件Image-Pro Plus計算陽性顆?；叶戎?。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠胃黏膜組織學(xué)觀察

空白組大鼠胃黏膜完整、腺體規(guī)則，黏膜下層偶見淋巴細(xì)胞浸潤，無炎癥改變；模型組大鼠胃黏膜表面糜爛、破損，腺體腫脹，黏膜下層見大量淋巴細(xì)胞浸潤，部分形成淋巴聚集灶，呈現(xiàn)慢性胃炎病理改變；頭花蓼組大鼠胃黏膜比較完整，腺體規(guī)則，黏膜層和固有層散在少量淋巴細(xì)胞浸潤；如圖1。頭花蓼組大鼠胃黏膜病理評分介于空白組模型組之間，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 3組大鼠胃黏膜病理評分±s)Tab.1 Histological score of the gastric mucosa in 3 groups

(1)與空白組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05

2.2 頭花蓼對H.pylori感染大鼠胃黏膜Gas表達(dá)陽性細(xì)胞及其mRNA的影響

免疫組織化學(xué)染色顯示各組大鼠胃竇部Gas陽性細(xì)胞的免疫反應(yīng)物呈棕色顆粒，位于胞漿(如圖2)；原位雜交證實胃泌素mRNA的陽性信號出現(xiàn)于Gas陽性細(xì)胞的核周或核上區(qū)，與正常組比較，模型組Gas陽性細(xì)胞的數(shù)量增多、反映強(qiáng)度增強(qiáng)，Gas mRNA陽性信號加強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；頭花蓼組Gas陽性細(xì)胞數(shù)量較模型組比較減少、Gas mRNA陽性信號較模型組明顯減弱，3組陽性灰度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，如圖4。

2.3 頭花蓼對H.pylori感染大鼠胃黏膜SS表達(dá)陽性細(xì)胞及其mRNA的影響

免疫組織化學(xué)染色顯示各組大鼠胃竇部SS陽性細(xì)胞分布于胃竇黏膜的中、下層，偶見于上層，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，陽性反應(yīng)呈棕色顆粒，沉淀于胞漿，胞核陰性(如圖4)；原位雜交實驗證實SS mRNA陽性信號出現(xiàn)于SS陽性細(xì)胞的胞核區(qū)。與正常組比較，模型組SS陽性細(xì)胞數(shù)量減少，SS mRNA陽性信號減弱，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；頭花蓼組SS陽性細(xì)胞數(shù)量較模型組比較增加，SS mRNA陽性信號無明顯增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，如圖5。

3 討論

H.pylori在全球人群中的自然感染率超過50%，全球各地差異甚大，發(fā)展中國家高于發(fā)達(dá)國家。而我國的H.pylori感染率較高，感染率為40%～90%，平均為59%[8]。因此控制H.pylori感染成為治療H.pylori相關(guān)性胃病的重要指標(biāo)，而目前單純西藥根除H.pylori的效果已不如從前，據(jù)報道西藥對H.pylori的根除率為70%[9]，對抗生素耐藥是H.pylori根除失敗的主要原因。因此研發(fā)高效的抗H.pylori藥物成為全球的研究熱點。

Gas和SS是人體重要的胃腸激素，Gas主要由存在于人體胃竇部的G細(xì)胞分泌，其可刺激壁細(xì)胞和主細(xì)胞促進(jìn)胃酸、胃蛋白酶分泌，增加胃腸黏膜的分裂增殖[10-11]；SS由人體胃竇部的D細(xì)胞分泌，其以旁分泌的方式抑制胃酸和胃蛋白酶分泌，亦可抑制Gas釋放，并對胃腸道的分泌、吸收、運動功能有普遍的抑制作用，對胃黏膜有直接的保護(hù)作用，二者在功能上相互協(xié)調(diào)，共同維持著胃腸的生

注：A為空白組，B為模型組，C為頭花蓼組圖1 大鼠胃黏膜組織HE染色(×200)Fig.1 HE staining of rat gastric mucosa

注：A為空白組，B為模型組,C為頭花蓼組圖2 大鼠胃黏膜Gas表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×200)Fig.2 Gas expression in gastric mucosa

注: A為空白組,B為模型組,C為頭花蓼組

(1)與空白組比較，P<0.05； (2)與模型組比較，P<0.05圖3 3組大鼠胃黏膜Gas陽性細(xì)胞及GAS mRNA表達(dá)(原位雜交，×100)Fig.3 Expression of Gas and Gas mRNA on rat gastric mucosa

注：A為空白組，B為模型組,C為頭花蓼組圖4 大鼠胃黏膜SS表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×200)Fig.4 SS expressing in rats gastric mucosa

注: A為空白組,B為模型組,C為頭花蓼組

(1)與空白組比較，P<0.05； (2)與模型組比較，P<0.05圖5 各組大鼠胃黏膜SS陽性細(xì)胞及SS mRNA表達(dá)(原位雜交,×100)Fig.5 Expression of SS and SS mRNA on rat gastric mucosa

理功能[12]。有研究顯示正常人與慢性胃炎病人胃腸激素的水平不同，變化的胃腸激素有可能會進(jìn)一步加重疾病的發(fā)展[13]，胃腸激素水平的檢測可判斷治療效果，具有一定的臨床意義。

本實驗采用免疫組織化學(xué)染色及原位雜交技術(shù)檢測H.pylori感染性胃炎胃黏膜Gas、SS激素及mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，H.pylori感染后模型組大鼠Gas激素及mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，而SS激素及mRNA表達(dá)水平僅有輕微的增高，推測感染H.pylori后會刺激胃竇部Gas分泌，使胃酸分泌增加，激活胃蛋白酶，破壞黏膜屏障，導(dǎo)致炎癥、潰瘍形成[14]。經(jīng)過頭花蓼治療以后，Gas激素及mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)，而SS激素及mRNA表達(dá)水平無明顯變化，這提示頭花蓼對SS的分泌的影響并不明顯，其改善胃黏膜的作用主要是通過抑制Gas的分泌實現(xiàn)的。Yana Zavros等[15]也研究表明抑制Gas分泌可有效的抑制H.pylori感染性胃炎。因此，推測頭花蓼除了直接抑制H.pylori增殖外，還具有調(diào)節(jié)胃腸激素的分泌的功能，維持胃腸道的正常生理功能，有助于炎癥的恢復(fù)。

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(2016-09-26收稿，2016-11-17修回)

中文編輯： 劉 平； 英文編輯： 劉 華

Effects ofPolygonumCapitatumon Gastrin and Somatostatin inHelicobacterpylori-infected Gastritis

JIAN Dan1, WEN Lina2, SUN Chaoqin1, MO Fei1, LI Yongnian1

(1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China, 2.TheSecondAffiliatedHospitalofGuiyangMedicalcollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550002,Guizhou,China)

Objective: To investigate the effect ofPolygonumcapitatumon gastric mucosal gastrin (Gas) and somatostatin(SS) expression of SD rats infected byH.pyloriand to explore the mechanism ofPolygonumcapitatumagainstH.pyloriinfection gastritis. Methods: 42 rats were divided into model group of 26 rats and blank control group of 16 rats. Establishment ofH.pylorirat model of chronic gastritis was established in rats by intragastric administration ofH.pyloristandard strain. After successful modeling, rats were divided into model group andPolygonumcapitatumgroup.Polygonumcapitatumgroup was given 1.72g extractum/kg dose ofPolygonumcapitatumby intragastric administration while model group and blank group were given equal volume of saline by intragastric administration. After 2 weeks of treatment, the rats were killed, the gastric mucosa was taken and the histological changes of gastric mucosa were observed by HE staining. Immunohistochemical staining was used to observe the changes of Gas positive cells and SS positive cells in gastric mucosa. The expression levels of mRNA Gas and mRNA SS in gastric mucosa were detected by in situ hybridization. Results: Compared with the model group,Polygonumcapitatumcan significantly alleviate the inflammation of the gastric mucosa of rats infected with H.pylori, and the pathological score decreased significantly (P<0.05). The number of Gas positive cells of gastric mucosa inPolygonumcapitatumgroup significantly decreased and the expression level of Gas mRNA decreased significantly. The difference was statistically significant (P<0.05). There was no statistically significant difference in the number of SS positive cells and mRNA SS expression level between the model group andPolygonumcapitatumgroup (P>0.05). Conclusion:Polygonumcapitatumcan repair gastric mucosal damage in chronic gastritis infected withH.pylori, and its mechanism may be related to improving the stomach intestine hormone regulation.

Helicobacterpylori; gastritis;Polygonumcapitatum; gastrin; somatostatin

貴州省科學(xué)技術(shù)基金[黔科合(2014)2027號]；貴州省科技合作計劃基金[黔科合LH(2015)7417號]；貴州省衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)基金(gzwikj2015-1-003)；貴陽市科技局計劃項目[筑科合同(2014001)]

時間：2016-12-15

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161215.1534.004.html

R285.5； R573.3

A

1000-2707(2016)12-1402-06

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.12.008

**貴州醫(yī)科大學(xué)2015級研究生

***通信作者 E-mail:418611579@qq.com； 15338505721@qq.com