miRNA-1181通過抑制STAT3影響人胰腺癌細胞的侵襲轉移能力*

王 杰， 喻 超， 周顯飛， 蔡 坤， 何志偉， 江建新

(貴州醫(yī)科大學附院 肝膽外科， 貴州 貴陽 550004)

?

miRNA-1181通過抑制STAT3影響人胰腺癌細胞的侵襲轉移能力*

王 杰， 喻 超， 周顯飛， 蔡 坤， 何志偉， 江建新**

(貴州醫(yī)科大學附院 肝膽外科， 貴州 貴陽 550004)

目的： 探討miRNA-1181(miR-1181)對人胰腺癌細胞侵襲轉移能力的影響以及機制。方法： 選取胰腺癌細胞系PANC-1和MIA PaCa-2進行實驗并構建miR-1181過表達慢病毒載體(miR-1181U)，低表達慢病毒載體(miR-1181D)以及空載慢病毒載體(NC)，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測感染效率；Transwell實驗以及劃痕實驗檢測miR-1181對胰腺癌細胞侵襲轉移能力的影響，免疫熒光檢測miR-1181對細胞骨架的影響，Western bolt檢測STAT3的表達；構建si-STAT3并轉染miR-1181低表達組(miR-1181D)，重復transwell實驗驗證STAT3是其靶基因。結果： qRT-PCR顯示3條不同序列的si-STAT3均能顯著下調STAT3的表達；Transwell實驗及劃痕實驗顯示上調miR-1181后能顯著抑制胰腺癌細胞的侵襲轉移(P<0.05)，下調miR-1181后能顯著促進胰腺癌的侵襲轉移(P<0.05)；Western blot顯示miR-1181U能抑制STAT3的表達，miR-1181D能促進STAT3的表達；免疫熒光顯示在PANC-1細胞中過表達miR-1181后，F(xiàn)-肌動蛋白(F-actin)被剪切，呈現(xiàn)低表達，導致其運動結構和極性的缺失，從而遷移能力變弱；si-STAT3以后能減弱miR-1181D組對侵襲轉移的促進作用。結論： miR-1181可能通過抑制STAT3來抑制人胰腺癌細胞的侵襲轉移能力，有望成為胰腺癌治療的潛在靶點。

胰腺腫瘤； miR-1181； 腫瘤侵襲； 腫瘤轉移； STAT3

胰腺癌是全球致死性排名第四的惡性腫瘤[1]，預計到2030年排名有望上升至第2位[2]。腫瘤細胞早期的惡性侵襲及遠處轉移是其治療效果差，預后不良的主要原因之一[3]。微小RNA(miRNAs)在人類多種疾病特別是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演了關鍵的角色，通過對靶基因轉錄后調控進而影響腫瘤細胞的增殖、侵襲轉移以及凋亡等進程[4]。本研究前期實驗結果已經證實miR-1181在胰腺癌中呈低表達，并已成功構建上調組慢病毒(miR-1181U)、陰性對照組慢病毒(NC)以及下調組慢病毒(miR-1181D)，證實miR-1181能通過調控STAT3影響胰腺癌干細胞的干性[5]，本文主要探究miR-1181對胰腺癌侵襲轉移的影響及機制。

1 材料和方法

1.1 細胞株和制劑

人胰腺癌細胞株PANC-1、MIA PaCa-2由華中科技大學附屬同濟醫(yī)院膽胰外科實驗室饋贈，高糖DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司，慢病毒載體由上海吉凱公司負責包裝和構建，Transwell小室購自美國Corning公司，STAT3(1∶500)抗體以及P-STAT3(1∶500)抗體購自美國CST公司，siSTAT3購自上海生工，鬼筆環(huán)肽、β-tubulin以及DAPI購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 將前期研究已感染慢病毒的胰腺癌細胞PANC-1和MIA PaCa-2置于高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS)，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞分為上調組(miR-1181U)、下調組(miR-1181D)、陰性對照組(NC)以及空白對照組(BC)。

1.2.2 siRNA轉染 分別制備PANC-1和MIA PaCa-2細胞懸液，密度為2×105個/mL，并分別接種于六孔板中，待其融合度達到50%，分別將3條序列不同的si-STAT3和si-NC與lipofectamine 3 000混合孵育20 min后加入每孔中，24 h后細胞換液，96 h后采用qRT-PCR驗證轉染效率，選取轉染效果最好的一條si-STAT3用于后續(xù)實驗。

1.2.3 transwell小室細胞遷移實驗 分別制備PANC-1和MIA PaCa-2細胞懸液(用不含血清(FBS)的培養(yǎng)基重懸)，密度為1×105個/mL，取200 μL細胞懸液于transwell小室的上室面，下室面放入含10% FBS的600 μL培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后用PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色30 min，用棉簽擦去上室面細胞，晾干，拍照。

1.2.4 Matrigel 細胞侵襲實驗 用無血清培養(yǎng)基和基質膠按1∶8稀釋，每孔加入60 μL，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中放置4 h，待膠凝固后進行實驗。實驗步驟同上述遷移實驗。

1.2.5 細胞劃痕實驗 用0.25%胰蛋白酶分別消化PANC-1和MIA PaCa-2細胞，于六孔板中每孔接種5×105個細胞，待孔內細胞長滿時，用200 μL槍頭垂直劃幾條直線，并在0、24 h分別在倒置顯微鏡下觀察。

1.2.6 細胞骨架免疫熒光 制備PANC-1和MIA PaCa-2細胞爬片，密度為1×105個/mL，待其貼壁后4%多聚甲醛固定。觀察當天取出PBS洗滌2遍，再用0.1%Triton X-100的PBS洗滌3～5 min，于1%BSA中封閉1 h。分別制備1∶50以及1∶100的熒光素鬼筆環(huán)肽及β-tubulin置于玻片上染色2 h，PBS再次洗滌2次，DAPI染色10 min，最后PBS洗滌后封片劑封片，于共聚焦激光顯微鏡下觀察。

1.2.7 GAPDH、STAT3及p-STATS表達 收集細胞提取蛋白，采用BCA法測蛋白濃度后按50 ng上樣量計算出上樣體積，SDS-凝膠電泳，孵育GAPDH(1∶1 000)、STAT3(1∶500)、p-STAT3(1∶500)一抗4度搖床過夜，室溫孵育二抗2 h后用ECL化學發(fā)光試劑曝光，Western bolt檢測GAPDH、STAT3及p-STAT3的蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 qRT-PCR驗證轉染效率

分別轉染3條不同序列si-STAT3于PANC-1和MIA PaCa-2細胞后，STAT3的基因表達量明顯低于NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，圖1。

(1)P<0.05圖1 轉染siSTAT3后STAT3的表達Fig.1 The expression of STAT3 after transfected siSTAT3

2.2 miR-1181抑制胰腺癌細胞的侵襲和轉移

Transwell小室實驗顯示,PANC-1和MIA PaCa-2細胞的miR-1181U組侵襲轉移能力均明顯受到抑制，細胞侵襲轉移數(shù)量明顯少于NC組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2)。相反，PANC-1和MIA PaCa-2細胞的miR-1181D組侵襲轉移能力均明顯增強，細胞侵襲轉移數(shù)量明顯多于NC組，而miR-1181D+si-STAT3組則侵襲轉移能力變弱，細胞侵襲轉移數(shù)量明顯少于miR-1181D組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖3)。細胞劃痕實驗結果顯示,miR-1181U組細胞遷移的距離明顯短于NC及BC組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖4)。

2.3 miR-1181對細胞骨架的影響

在PANC-1細胞中過表達miR-1181后，F(xiàn)-肌動蛋白(F-actin)被剪切，呈現(xiàn)低表達，導致其運動結構和極性的缺失，從而遷移能力變弱。BC組和NC組中，F(xiàn)-actin不被剪切，大量聚集形成偽足和極性，為間充質移動方式向阿米巴樣移動方式的轉變過程提供所必須的運動結構和極性，故遷移能力強(圖5)。

2.4 STAT3及P-STAT3的蛋白表達

Western bolt結果顯示，上調miR-1181后能抑制STAT3以及磷酸化STAT3的表達，而下調miR-1181后則促進STAT3以及磷酸化STAT3的表達(圖6)。

3 討論

MicroRNA(miRNA)是一組由19～22個核苷酸組成的內源性非編碼小RNA，它能通過與靶mRNA的3’UTR特異性結合，在轉錄后水平調控基因的表達[6]。大量研究表明，這些單鏈RNA在細胞的正常生命周期中發(fā)揮至關重要的作用[7-9]。Zhang B等[10]研究表明miR-489在胃癌之中扮演了抑癌基因的角色，通過直接作用于PROX1蛋白抑制胃癌的侵襲轉移轉移能力。Wang C等[11]研究發(fā)現(xiàn)MiR-323-3p能在胰腺癌中抑制腫瘤細胞的增殖以及侵襲轉移，且通過直接抑制靶蛋白SMAD2以及SMAD3實現(xiàn)抑制胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展。STAT3(信號傳導及轉錄激活因子3)在一系列細胞過程中扮演了重要的角色，如細胞增殖、凋亡以及免疫抑制等[12]。JAK-STAT信號通路最初是發(fā)現(xiàn)于干擾素α，干擾素γ以及白介素6共同參與調控的下游信號通路[12]。STAT3在信號傳導及

注：A為PANC-1，B為MIA PaCa-2；(1)P<0.05圖2 miR-1181對胰腺癌細胞侵襲轉移能力的影響(transwell)Fig.2 Transwell assay detected the effect of miR-1181 on migration and invasion of pancreatic cancer

注：A、B為PANC-1，C、D為MIA PaCa-2；(1)P<0.05圖4 miR-1181對胰腺癌細胞遷移能力的影響(劃痕實驗)Fig.4 Wound healing assay detected the effect of miR-1181 on invasion of pancreatic cancer

圖5 免疫熒光檢測miR-1181對細胞骨架的影響(600×)Fig.5 Immunofluorescence detected the influence of miR-1181 on cytoskeleton

圖6 miR-1181對STAT3及p-STAT3表達的影響(Western bolt)Fig.6 Western bolt detected the effect of miR-1181 on STAT3 and p-STAT3

轉錄激活上發(fā)揮了關鍵性的作用[13]。目前已發(fā)現(xiàn)STAT家族有6個成員，STAT3是家族中最普遍存在的，當接受細胞因子或者生長因子刺激后，STAT3作用于細胞核內以二聚體的形式特異性結合DNA片段，調控目的基因的轉錄。如果通路持續(xù)激活，將導致細胞的惡性增殖以及周邊侵襲[13]。STAT3能通過各種靶基因促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，包括細胞周期調控因子，血管生成因子以及抗凋亡基因等[14]。

本研究通過transwell實驗，細胞劃痕實驗初步驗證了miR-1181能抑制胰腺癌的侵襲轉移能力。并通過western bolt觀察了miR-1181對靶蛋白STAT3的影響，即過表達miR-1181能抑制STAT3的表達，低表達miR-1181能促進STAT3的表達。進一步我們人為干擾了STAT3的表達后，發(fā)現(xiàn)miR-1181D組的促進作用被抑制。免疫熒光實驗結果顯示，在PANC-1細胞中過表達miR-1181后，F(xiàn)-肌動蛋白(F-actin)被剪切，呈現(xiàn)低表達，導致其運動結構和極性的缺失，從而遷移能力變弱。miR-1181U組F-肌動蛋白和β-微管蛋白較NC及BC組明顯減少，BC組和NC組中，F(xiàn)-actin不被剪切，大量聚集形成偽足和極性，為間充質移動方式向阿米巴樣移動方式的轉變過程提供所必須的運動結構和極性，故遷移能力強。綜上我們可以得出結論，miR-1181能通過抑制STAT3的表達來影響胰腺癌細胞的侵襲轉移能力。

總之，miR-1181在胰腺癌中作為一種抑癌基因，能抑制胰腺癌細胞的侵襲轉移，有望成為治療胰腺癌的新靶點。

[1] Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2013(1): 11-30.

[2] Erratum for PMID 21180585[J]. Therap Adv Gastroenterol, 2012(5): 371.

[3] Hidalgo M. Pancreatic cancer[J]. N Engl J Med, 2010(17): 1605-1617.

[4] Ambros V. The functions of animal microRNAs[J]. Nature， 2004(6): 350-355.

[5] Jiang J, Li Z, Yu C, et al. MiR-1181 inhibits stem cell-like phenotypes and suppresses SOX2 and STAT3 in human pancreatic cancer[J]. Cancer Lett, 2015(2): 962-970.

[6] Humeau M, Torrisani J, Cordelier P. miRNA in clinical practice: pancreatic cancer[J]. Clin Biochem, 2013(10): 933-936.

[7] Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism and function[J]. Cell, 2004(2): 281-297.

[8] He L, Hannon GJ. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation[J]. Nat Rev Genet, 2004(7): 522-531.

[9] Szafranska AE, Davison TS, John J, et al. MicroRNA expression alterations are linked to tumorigenesis and non-neoplastic processes in pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Oncogene, 2007(30): 4442-4452.

[10]Zhang B, Ji S, Ma F, et al. miR-489 acts as a tumor suppressor in human gastric cancer by targeting PROX1[J]. Am J Cancer Res, 2016(9): 2021-2030.

[11]Wang C, Liu P, Wu H, et al. MicroRNA-323-3p inhibits cell invasion and metastasis in pancreatic ductal adenocarcinoma via direct suppression of SMAD2 and SMAD3[J]. Oncotarget, 2016(12): 14912-14924.

[12]Zhao C, Li H, Lin HJ, et al. Feedback Activation of STAT3 as a Cancer Drug-Resistance Mechanism[J]. Trends Pharmacol Sci, 2016(1): 47-61.

[13]Niit M, Hoskin V, Carefoot E, et al. Cell-cell and cell-matrix adhesion in survival and metastasis: Stat3 versus Akt[J]. Biomol Concepts, 2015(5): 383-399.

[14]Wake MS, Watson CJ. STAT3 the oncogene-still eluding therapy[J]. FEBS J, 2015(14): 2600-2611.

(2016-09-16收稿，2016-11-13修回)

中文編輯： 劉 平； 英文編輯： 蘇曉慶

Capacity of miRNA to Influence the Migration and Invasion of Pancreatic Cancer through Inhibiting STAT3

WANG Jie, YU Chao, ZHOU Xianfei, CAI Kun, HE Zhiwei, JIANG Jianxin

(DepartmentofHepatic-Biliary-PancreaticSurgery,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,GuizhouChina)

Objective: To investigate the effect of microRNA-1181 on the migration and invasion of pancreatic cancer and its potential mechanism. Methods: Lentiviral vectors of miR-1181 including overexpression (miR-1181U), knockdown (miR-1181D) and a negative control (NC) were constructed, and were transfected into human pancreatic cancer cell lines PANC-1 and MIA-PaCa-2 respectively. The expressions of miR-1181 were detected by real-time PCR. Transwell assay and wound healing assay were employed to detect cell invasion ability. The influence of miR-1181 on cytoskeleton was detected with immunofluorescence technique, and the expression of STAT3 detected by Western bolt. siRNA for STAT3 was constructed and transfected into miR-1181D, and then transwell assay was repeated to ensure that STAT3 was the miR-1181's target. Results: qRT-PCR results showed that 3 different si-STAT3 decreased expression of STAT3. Transwell assay and wound healing assay showed that miR-1181U inhibited cell migration and invasion (P<0.05), and miR-1181D promoted cell migration and invasion (P<0.05) significantly. Furthermore, miR-1181U inhibited the expression of STAT3 while miR-1181D up-regulated the expression of STAT3. Immunofluorescence test showed that when miR-1181 overexpressed in PANC-1 cells, F-actin was cut, and its expression was low. As the results, cells lost movement structure and polarity, and their migration capability was weakened. si-STAT3 can decrease the promotion effect of miR-1181 on migration and invasion in pancreatic cancer. Conclusion: miR-1181 may inhibit cell migration and invasion of pancreatic cancer by suppressing STAT3, which suggests it might be a potential new therapeutic agent for pancreatic cancer.

pancreatic neoplasms; miR-1181; tumor migration; tumor invasion; STAT3

國家國際科技合作專項資助(2014DFA31420); 國家自然科學基金(81160311，81572429，81660483)

時間：2016-12-15

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161215.1534.014.html

R735.9

A

1000-2707(2016)12-1387-06

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.12.005

**通信作者 E-mail:jjx731003@163.com