胰腺癌細胞總RNA轉(zhuǎn)染樹突細胞與胰腺癌-樹突融合細胞激發(fā)特異性細胞毒T淋巴細胞能力的比較研究

陳 江 李宏宇 王 迪 許文達 郭曉鐘

胰腺癌細胞總RNA轉(zhuǎn)染樹突細胞與胰腺癌-樹突融合細胞激發(fā)特異性細胞毒T淋巴細胞能力的比較研究

陳 江 李宏宇 王 迪 許文達 郭曉鐘

目的比較人胰腺癌MiaPaCa-2細胞總RNA電轉(zhuǎn)染樹突細胞（Dendritic Cell,DC）與DCM iaPaCa-2融合細胞體外激發(fā)抗原特異性細胞毒T淋巴細胞（Cytotoxic T Lymphocyte,CTL）能力的差異。方法自6例胰腺癌患者外周血單核細胞中分離、培養(yǎng)DC。使用電穿孔法將M iaPaCa-2細胞總RNA轉(zhuǎn)染DC，使用細胞融合方法將胰腺癌M iaPaCa-2細胞抗原負載DC，以未負載抗原的DC為對照。使用流式細胞術(shù)（FCM）檢測PE-MUC/FITC-CD86抗體雙標細胞評估融合效率；四甲基偶氮唑鹽（MTT）檢測轉(zhuǎn)染各組DC存活率；混合細胞培養(yǎng)法評價各組DC體外刺激自體T淋巴細胞增殖能力；ELISA法檢測各組DC體外激發(fā)抗原特異性CTL因子釋放量。結(jié)果采用PEG-DMSO誘導的DC與M iaPaCa-2的融合細胞同時表達DC表型和MUC1分子，CD86與MUC1雙陽性表達率為（42.3±7.30）%;融合細胞組DC存活率呈時間依賴性下降，轉(zhuǎn)染后96h的存活率降低至62.81%，而M iaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染組DC細胞存活率穩(wěn)定在85%左右，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染M iaPaCa-2總RNA DC刺激自體T細胞增殖指數(shù)（DC∶T=1∶10）為8432±611.25，顯著高于DC-MiaPaCa-2融合細胞（DC∶T=1∶10）5672±107.51（P＜0.05）；且MiaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染DC激發(fā)特異性CTL分泌IL-12p70、IL-10和IFN-γ細胞水平亦顯著異于DC-M iaPaCa-2融合細胞（P＜0.05）。結(jié)論胰腺癌細胞總RNA轉(zhuǎn)染DC較胰腺癌-樹突融合細胞有更強的體外抗原特異性CTL激發(fā)能力。

樹突細胞；RNA轉(zhuǎn)染；細胞融合；胰腺腫瘤；細胞毒性T淋巴細胞

胰腺癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，多數(shù)病例在發(fā)現(xiàn)時已屬晚期，手術(shù)治療及放、化療作用有限，患者預后極差，臨床迫切需要探索新的有效治療手段[1]。樹突細胞（Dendritic cell,DC）是體內(nèi)功能最為強大的抗原遞呈細胞（antigen presenting cell, APS），能夠刺激并致敏T淋巴細胞，產(chǎn)生細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lynphocytes,CTLs），是機體免疫應(yīng)答的核心。近年來出現(xiàn)的以DC為基礎(chǔ)構(gòu)建的腫瘤疫苗技術(shù)對多種腫瘤均有顯著的治療作用，為胰腺癌的臨床治療開辟了新的思路[2-4]。腫瘤細胞總RNA轉(zhuǎn)染DC疫苗和DC-腫瘤細胞融合疫苗是當前DC腫瘤疫苗構(gòu)建免疫治療的兩個熱點方向[5]。本研究通過比較人胰腺癌M iaPaCa-2細胞總RNA電轉(zhuǎn)染DC和DC-M iaPaCa-2融合細胞體外激發(fā)抗原特異性CTL能力的差異，為臨床選擇更為高效的DC腫瘤疫苗構(gòu)建策略提供前期實驗依據(jù)。

材料與方

一、一般材料及試劑

篩選2014年6月至2016年1月期間沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化科收治的6例HLA-A2+晚期胰腺癌患者，男性4例，女性2例，年齡35～65歲，平均年齡50歲。全部患者均經(jīng)組織病理學檢查（剖腹探查活檢4例，細針穿刺活檢2例）證實為胰腺癌。入選前未經(jīng)放、化療及免疫治療。所有患者均簽署知情同意書，并經(jīng)本院倫理委員會批準。

人胰腺癌細胞株M iaPaCa-2（沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化科實驗室）；RPM I 1640、小牛血清（Hyclone公司，美國），rhGM-CSF、rhIL4、TNFα（PeproTec公司，美國），鼠抗人CD80、HLA-DR、CD83和CD86單抗（Santa-Cruz公司，美國），兔抗人MUC1多克隆抗體（DPC-Biermann公司，德國），TRIzol、MTT、50%PEG-10%DMSO溶液、Ficoll淋巴細胞分離液（Sigma公司，美國），3H標記甲基胸腺嘧啶（中科院原子能所），IL-12p70、IL-10、TNF-α和IFN-γ細胞因子檢測試劑盒（BD公司，美國）。

二、DC的分離、培養(yǎng)和鑒定

參照文獻[6]方法，通過Ficoll密度梯度離心法，分離來自胰腺癌患者100m L外周血中單核細胞（PBMCs），貼壁1 h后，取出未貼壁的細胞另作培養(yǎng)備用。貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)20 h后，更換新鮮培養(yǎng)液，加入rhGM-CSF（800 IU/m L）和rhIL-4（500 IU/ m L）。37℃，5%CO2，培養(yǎng)5 d后加入TNF-α（10 ng/ m L），培養(yǎng)至7 d，收集成熟DCs。使用倒置顯微鏡和電鏡連續(xù)觀察體外培養(yǎng)5～10 d DCs形態(tài)學變化。

三、胰腺癌M iaPaCa-2細胞總RNA提取、鑒定和轉(zhuǎn)染

收獲M iaPaCa-2細胞，加入Trizol試劑1m L充分裂解，5m in后加入氯仿200μL，4℃12 000 r/ m in離心15m in，加入異丙醇500μL，室溫放置20 m in，4℃12 000 r/m in離心15m in，棄上清，加入75%乙醇1m L漩渦器震蕩混均，4℃12 000 r/m in離心15 m in。棄上清，超凈臺晾干后溶于25μL DEPC水。分光光度計測定A260/A280值，計算RNA純度和含量，1%變性凝膠電泳測RNA完整性后-80℃保存。

[7]的方法，取200μL培養(yǎng)5 d的未成熟DCs細胞懸液加入2mm的電極杯，加入20μg M iaPaCa-2總RNA。調(diào)整電壓300 V、間隔125ms、4個脈沖，持續(xù)250ms進行電轉(zhuǎn)染。電穿孔后立刻置入4℃冰箱靜置10min，移入加有完全培養(yǎng)基的12孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)0～96 h。以未轉(zhuǎn)染RNA的mock-DC作為對照組。

四、細胞融合

選取連續(xù)傳代培養(yǎng)20代后仍能穩(wěn)定表達MUC1蛋白[8]的M iaPaCa-2細胞，使用25μg/m L絲裂霉素處理30m in，去增殖后與培養(yǎng)5 d的DC以3∶1混合，離心盡量吸盡上清，置37℃水浴中，滴加預熱的50%PEG-10%DMSO溶液0.8m L，作用2 m in后加入1m L血清終止反應(yīng)，未排除細胞間粘附及DC吞噬M iaPaCa-2細胞對實驗結(jié)果的影響，以不加融合劑的mock-DC為對照。收集培養(yǎng)細胞，采用FITC-CD86及PE-MUC1雙標記法，經(jīng)流式細胞儀檢測細胞融合率，融合率（%）=（融合組雙標率-共培養(yǎng)組雙標率）×100%。同時，使用MTT法檢測各組DC存活率變化。

五、DC標志物檢測

使用流式細胞法，分別檢測轉(zhuǎn)染M iaPaCa-2細胞總RNA及與M iaPaCa-2細胞融合后48 h的DC特異性標志物CD80、DC特征性成熟標志CD83、共刺激分子CD86以及MHC類分子HLA-DR等的表達水平，比較兩者差異。

六、不同RNA轉(zhuǎn)染組DC體外刺激自體T淋巴細胞增殖實驗

分別收集不同轉(zhuǎn)染組DCs，調(diào)節(jié)細胞濃度為1 ×105/m L作為刺激細胞，分選并調(diào)節(jié)患者自體PBMCs中的懸浮T淋巴細胞，濃度為1×106/m L作為反應(yīng)細胞，按照刺激與效應(yīng)細胞l∶10，l∶20，l∶40和l∶80比例加入到96孔板中，終體積200μL，在37℃，5%CO2培養(yǎng)5 d，收獲細胞前18 h加入3HTdR，每孔1μCi。以RPM I-1640培養(yǎng)基替代效應(yīng)細胞的4個孔作為對照組，使用液閃爍儀檢測每分鐘脈沖數(shù)（CPM）。

七、不同RNA轉(zhuǎn)染組DC體外激發(fā)抗原特異性CTL釋放細胞因子

以不同轉(zhuǎn)染組DC為刺激細胞，以患者自體T淋巴細胞為效應(yīng)細胞，刺激與效應(yīng)細胞按l∶10比例混合反應(yīng)14 d后，應(yīng)用ELISA法，按試劑盒操作說明書檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-12p70、IL-10、TNF-α和IFN-γ水平。細胞培養(yǎng)上清用試劑盒中樣本稀釋液稀釋50倍后檢測。每個樣本設(shè)3個復孔，取平均值。

八、統(tǒng)計學處理

圖1 體外培養(yǎng)DC及胰腺癌M iaPaCa-2細胞形態(tài)表現(xiàn)

結(jié) 果

一、DC與M iaPaCa-2細胞的體外培養(yǎng)和鑒定DC經(jīng)體外分離、培養(yǎng)，數(shù)量可達初始數(shù)量的10～15倍。鏡下可見胞體向四周伸出大量樹枝狀或裙褶狀不規(guī)則突起，部分突起末端呈球狀膨大（圖1 A、B）M iaPaCa-2細胞呈集落樣生長，條索狀，異型性明顯（圖1 C）。

二、融合細胞的鑒定與融合率的檢測

倒置顯微鏡下可見，經(jīng)50%PEG-10%DMSO溶液誘導融合后，部分DCs與M iaPaCa-2細胞先發(fā)生細胞膜融合，形成雙核的巨大細胞，而后細胞核逐漸發(fā)生融合，形成DC與M iaPaCa-2細胞的雜交細胞（DC-M iaPaCa-2）。

M iaPaCa-2為MUC1陽性細胞，不表達CD86抗原；而CD86為成熟DC特異性表面標志物之一，DC為CD86陽性細胞，不表達或低表達MUC1抗原。采用FITC-CD86及PE-MUC1雙標記法檢測融合細胞，結(jié)果示融合細胞組CD86及MUC1雙陽性的DC比率為（42.3±7.30）%（圖2），而共培養(yǎng)組CD86及MUC1雙陽性DC比率為（7.21±1.06）%，除去細胞粘附等因素作用，DC-M iaPaCa-2融合細胞形成率為（35.09±6.24）%。

三、DC存活率變化情況

M iaPaCa-2細胞總RNA轉(zhuǎn)染后0～96 h，DC存活率變化較小，穩(wěn)定在85%左右，而M iaPaCa-2細胞與DC融合后，融合細胞存活率呈現(xiàn)時間依賴性降低，96 h時，DC-M iaPaCa-2融合細胞存活率低至61.23%（P＜0.05），見圖3。

四、不同分組DC體外刺激自體T淋巴細胞增殖實驗

以M iaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染DC、DC-M ia-PaCa-2融合細胞及mock-DC作為刺激細胞，各組刺激細胞與自體T淋巴細胞混合培養(yǎng)，結(jié)果顯示在DC∶T=1∶10時，DC-M iaPaCa-2 RNA細胞刺激自體T細胞增殖指數(shù)為8432±611.25，顯著高于DCM iaPaCa-2融合細胞的5672±107.51（P＜0.05）及Mock-DC的257±32.16（P＜0.05）；且在DC∶T=1∶20時，DC-M iaPaCa-2 RNA組細胞刺激自體T細胞增殖指數(shù)為5852±153.03，亦高于DC-M iaPaCa-2融合細胞組的4276±130.01（P＜0.05）及Mock-DC組的108±17.18（P＜0.05）；而當DC∶T=1∶40及1∶80時，DC-M iaPaCa-2 RNA組細胞與DC-M ia-PaCa-2融合細胞刺激自體T細胞的增殖指數(shù)無顯著差異（P＞0.05）（圖4）。

圖2 與M iaPaCa-2細胞融合前后DC內(nèi)CD86、MUC1雙抗原相對表達情況

圖3 不同分組DC存活率變化情況[轉(zhuǎn)染后96 h，DCM iaPaCa-2細胞融合組細胞存活率顯著低于M iaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染組DC（*P＜0.05）]

圖4 DC-MiaPaCa-2融合組，DC-MiaPaCa-2RNA轉(zhuǎn)染組及M ock-DC組細胞刺激自體T細胞增殖實驗

五、不同分組DC體外激發(fā)抗原特異性CTL釋放細胞因子

M iaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染組DC、DC-M iaPaCa-2融合細胞及Mock-DC均具有刺激抗原特異性CTL分泌Th1型細胞因子的能力，但Mock-DC對CTLs的刺激作用較弱，幾可忽略不計。ELISA法檢測示，在DC∶T=1∶10時，M iaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染組DCs能激活自體特異性T細胞，其誘導特異性CTLs分泌IL-12p70和IFN-γ水平，顯著高于DCM iaPaCa-2融合細胞（P＜0.05）；而M iaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染組DCs誘導特異性CTL分泌的IL-10水平，顯著低于DC-M iaPaCa-2融合細胞；TNF-α水平兩組間無顯著變化（圖5）。

圖5 DC∶T=1∶10時，DC-M iaPaCa-2RNA轉(zhuǎn)染細胞誘導特異性CTL分泌IL-12p70和IFN-γ水平顯著高于DCMiaPaCa-2融合細胞，IL-10水平則明顯低于DC-M iaPaCa-2融合細胞（*P＜0.05）

討 論

DC腫瘤疫苗的實質(zhì)是以特異性T細胞為基礎(chǔ)的細胞免疫，而胰腺癌DC疫苗構(gòu)建的關(guān)鍵在于選擇合適的腫瘤抗原。胰腺癌缺乏特異性腫瘤抗原、異質(zhì)性大、免疫原性差，使用單腫瘤抗原負載DC構(gòu)建胰腺癌腫瘤疫苗時，其誘導的免疫反應(yīng)通常較弱；而使用腫瘤全抗原負載DC構(gòu)建胰腺癌疫苗則可激活針對不同腫瘤特異性抗原的多克隆細胞，減少腫瘤細胞克隆變異引起的抗原缺失，從而可以減少免疫逃逸的發(fā)生率，理論上是較具優(yōu)勢的DC腫瘤疫苗的構(gòu)建策略[9]。

腫瘤細胞總RNA電轉(zhuǎn)染DC疫苗與腫瘤-DC融合細胞疫苗，是當前臨床研究中受關(guān)注較多的兩種癌細胞全抗原負載DC疫苗制備方案。腫瘤-DC融合細胞是通過細胞融合技術(shù)將腫瘤細胞抗原導入DC，獲得的雜交細胞既有DC的表面特征和功能，又能內(nèi)源性表達腫瘤相關(guān)蛋白。負載有腫瘤細胞全抗原的DC能夠體外激活T淋巴細胞多克隆性增殖，并促進相關(guān)CTLs分泌大量功能性細胞因子。而腫瘤細胞總RNA電轉(zhuǎn)染DC，是通過RNA電轉(zhuǎn)染技術(shù)，將含有腫瘤細胞全部抗原信息的總RNA導入DC胞內(nèi)，在胞漿內(nèi)對相關(guān)抗原基因進行轉(zhuǎn)錄，翻譯，最終將腫瘤細胞抗原信息表達于DC表面，呈遞并激活相關(guān)CTLs，實現(xiàn)特異性抗腫瘤免疫效應(yīng)。

腫瘤-DC融合細胞疫苗的優(yōu)勢包括：①DC-腫瘤融合細胞能表達整個腫瘤細胞抗原決定簇，因而能誘導產(chǎn)生多克隆的CTL反應(yīng)；②DC-腫瘤融合細胞既表達腫瘤抗原，又表達包括MHC、共刺激信號分子在內(nèi)的DC表面抗原，使細胞介導的抗腫瘤免疫應(yīng)答大大增強[10]；③DC-腫瘤融合疫苗能夠?qū)⒁阎臀粗哪[瘤相關(guān)抗原加工后呈遞給T淋巴細胞，發(fā)揮最佳的抗腫瘤免疫作用；④DC-腫瘤細胞融合后其抗原呈遞作用持久[11]，可誘導出更強的免疫應(yīng)答反應(yīng)。而腫瘤細胞總RNA轉(zhuǎn)染DC疫苗的優(yōu)勢體現(xiàn)在：①轉(zhuǎn)染的RNA只進入DC胞漿而非胞核，對細胞的損傷?。虎赗NA半衰期短，RNA轉(zhuǎn)染DC疫苗更為安全；③負載的腫瘤抗原可從很少的癌細胞中經(jīng)PCR擴增得來、RNA模板本身可經(jīng)進一步的序列修飾，穩(wěn)定性較強等[12]。RNA電轉(zhuǎn)染法則更具有操作簡單、安全、不受MHC遺傳背景影響等優(yōu)點[13]。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，利用腫瘤細胞總RNA電轉(zhuǎn)染技術(shù)，胰腺癌M iaPaCa-2細胞總RNA能夠成功負載DCs，且轉(zhuǎn)染過程中未出現(xiàn)抗原不良交互反應(yīng)。而利用50%PEG-10%DMSO誘導DC的細胞融合技術(shù)，可使DC-M iaPaCa-2融合細胞的融合效率大于40%，凸顯了該方法的有效性。胰腺癌M ia-PaCa-2細胞總RNA轉(zhuǎn)染后0～96 h，DCs存活率穩(wěn)定在85%左右，DC與胰腺癌M iaPaCa-2細胞融合后，細胞存活率在不同的時間點明顯降低，提示此現(xiàn)象可能與50%PEG-10%DMSO融合劑對DCs的毒性蓄積和細胞膜的破壞作用有關(guān)。使用此兩種方法負載胰腺癌M iaPaCa-2細胞總抗原后，DCs表面均可見細胞特異性CD80、HLA-DR、CD83和CD86分子的陽性表達，且表達水平無明顯差異，說明兩種方法對DC特異性共刺激分子及MHC表型分子的表達無顯著影響。

本實驗研究中，我們將DC-M iaPaCa-2融合細胞、DC-M iaPaCa-2 RNA轉(zhuǎn)染細胞及Mock-DC與自體T細胞混合培養(yǎng)，結(jié)果顯示在不同效靶比情況下，不同實驗組DCs均能刺激自體T細胞增殖。但DC-M iaPaCa-2 RNA轉(zhuǎn)染細胞對自體T細胞的增殖刺激能力顯著高于DC-M iaPaCa-2融合細胞和Mock-DC，提示隨著負載抗原效率的增加，DC刺激自體T細胞增殖的能力可顯著增強。DC腫瘤疫苗的最終目的在于其誘導體內(nèi)CTL反應(yīng)，進而對腫瘤細胞產(chǎn)生特異性殺傷效應(yīng)。隨著T細胞的增殖和特異性CTLs的擴增，活化的CTLs可分泌大量Th1型細胞因子，如IL-12、TNF-α和IFN-γ等，同時減少Th2型細胞因子，如IL10等的釋放，使得免疫反應(yīng)本身向著有利于腫瘤細胞殺傷的Th1反應(yīng)為主的方向發(fā)展。因此，DCs對體外CTL的刺激活化能力可間接使用IFN-γ等細胞因子的釋放量表示[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，DC-M iaPaCa-2融合細胞與M iaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染DCs均具有體外激發(fā)抗原特異性CTLs的能力，但DC-M iaPaCa-2 RNA可表現(xiàn)出更強的CTL激發(fā)效應(yīng)。此發(fā)現(xiàn)與Van Tendeloo等[14]的研究結(jié)果類似。提示胰腺癌細胞總RNA轉(zhuǎn)染DC法的抗原負載效率更強，其體外活化、激發(fā)抗原特異性CTLs的能力亦更強。

綜上所述，本研究結(jié)果表明人胰腺癌細胞總RNA轉(zhuǎn)染DC可表現(xiàn)出較胰腺癌-DC融合細胞更強的促進抗原特異性CTLs增殖和活化能力，此結(jié)果為臨床選擇更加有效的胰腺癌DC腫瘤疫苗構(gòu)建方式奠定了前期實驗基礎(chǔ)。

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Com parison of cytotoxic T lymphocyte induction by dendritic cells transfected with totalpancreatic can-cer RNA and fusion hybrided w ith tumor cell in vitro

CHEN Jiang,LIHong-Yu,WANG Di,XUWen-Da, GUO Xiao-Zhong．Departmentof Gastroenterology,Shenyang GeneralHospital of People Liberation Army, Shenyang 110016,China.Corresponding author:GUO Xiao-Zhong,Email:Guoxiaozhong1962@aliyun.com

ObjectiveTo compare theability of specific cytotoxic T lymphocytes(CTL)induction stimulated by dendritic cells(DC)transfectedw ith total RNA of human pancreatic cancer MiaPaCa-2 cell lines with DC fused with MiaPaCa-2 cell lines.MethodDCswere isolated and cultured from peripheral blood mononuclearcells(PBMCs).TotalRNA derived from MiaPaCa-2 cell lineswas transfected into DCsby electroporation.DCswere fused w ith M iaPaCa-2 cellsand the fusion efficiency wasassessed by flow cytometry (FCM).DC-MiaPaCa-2 hybridswere identified asPE-MUC1/FITC-CD86 double positive cells.The survival rate of DC wasdeterm ined by MTTmethod.The lymphocyte proliferation ability was evaluated bymixed cell culturemethod.The cytokines releasing of antigen-specific CTLsweremeasured by ELISA assay.ResultsDC-MiaPaCa-2 hybridswhich possessed both the phenotype of DC and MUC1 protein.The co-expression rate of both CD 86 and MUC1 positivity was（42.3±7.30）%.The survival rate of DCs transected w ith M ia-PaCa-2 total RNA were stabilized around 85%and the survival rate of DCs fused with MiaPaCa-2 cellswas 62.81%at96 hours(P＜0.05).The autologous T cell proliferation index of the total RNA of M iaPaCa-2 celllines transfection DC group was8432±611.25,significantly higher than the DC-M iaPaCa-2 hybrids5672± 107.51(P＜0.05);The secretion of IL-12p70,IL-10 and IFN-γlevels of the total RNA of MiaPaCa-2 cell lines transfection DC-specific CTL w ere significantly differentw ith DC-M iaPaCa-2 hybrids(P＜0.05).ConclusionDCs transfected with the total RNA of pancreatic cancer cells had a stronger ability to stimulate specific CTL in vitro than the DCs fusedwith pancreatic cancer cells.

Dendritic cells;RNA transfection;Cell fusion;Pancreatic cancer;Cytotoxic T lym phocytes

2016-09-19）

（本文編輯：喬偉光）

10.3969/j.issn.1672-2159.2016.05.006

110016沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化科

郭曉鐘，E-mail：Guoxiaozhong1962@aliyun.com

國家自然科學基金（81071982）