誘導性多能干細胞在心肌病中的應用

李萌萌綜述，周建業(yè)、宋江平審校

綜述

誘導性多能干細胞在心肌病中的應用

李萌萌綜述，周建業(yè)、宋江平審校

誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）的研究促進了再生醫(yī)學的發(fā)展。在外源因子作用下，分化成熟的細胞通過誘導去分化變?yōu)榫哂蟹只瘽撃艿亩嗄芨杉毎?，后者亦可再分化為其他細胞。心肌病是心血管疾病中一類常見疾病，終末期可進展為心力衰竭，是目前世界范圍內(nèi)主要致死因素之一。本文對iPSC在心肌病臨床和基礎研究中的應用作一綜述。

綜述； 心肌??；干細胞

2006年,日本科學家Yamanaka等首次將胚胎干細胞（ESC）富含的4個重要轉(zhuǎn)錄因子Oct4, Sox2, Klf4和 c-Myc（Yamanaka 因子） 通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染到小鼠胚胎成纖維細胞中，成功誘導出一種具有分化潛能的細胞,因此命名為誘導性多能干細胞（iPSC）[1]。隨著iPSC技術的推廣,從肝臟細胞，神經(jīng)元細胞，角質(zhì)細胞中成功誘導出iPSC[2]。心肌病是一類復雜疾病，終末期可以進展為心臟衰竭，其具體分子機制尚不明確[3]。心肌病分子機制研究的一大瓶頸是建立體外細胞模型及獲取人源心肌組織，而動物模型又不能完全模擬人體的疾病狀態(tài)。通過將患者iPSC分化為心肌細胞，攜帶有患者全部遺傳信息，并在體外建立其相應心肌病的細胞模型甚至心肌微組織，可以用于心肌病發(fā)病機制研究并作為藥物篩選的細胞平臺[4]。同時iPSC來源于自體細胞，在增殖分化潛能上有胚胎干細胞的特性，且獲取較為容易，也避免了直接研究胚胎干細胞帶來的倫理學問題[5]。在分化效率上，iPSC明顯優(yōu)于間充質(zhì)干細胞[6]。將iPSC誘導分化為心肌細胞，這對心肌病致病機制的研究，尋找相應的信號通路以及致病靶點都起到至關重要的作用，極大地促進了心肌病基礎研究發(fā)展[7]。本文將重點討論iPSC在心肌病致病機制研究中的應用以及臨床治療。

1 iPSC與心肌病基礎研究

心肌病是我國乃至全世界人群中重要的致死因素之一[8]。如限制型心肌病在年輕人中的發(fā)病率為1/500, 擴張型心肌病每10萬人群中有40～50人患有該病[9]。心肌病主要分為原發(fā)性心肌病和獲得性心肌病，前者主要包括擴張型心肌病、致心律失常性右心室心肌病、肥厚型心肌病、限制型心肌病等，其中有相當一部分與遺傳突變相關；而后者有炎癥性心肌病[3]。此外，還有冠心病、瓣膜病等并發(fā)缺血性心肌病、瓣膜性心肌病等。

1.1 iPSC與擴張型心肌病

擴張型心肌病主要臨床特征為左心室擴張，收縮功能障礙，并最終導致心力衰竭，在成人中的發(fā)病率約為1/2500[10]。最近研究發(fā)現(xiàn)，肌小節(jié)蛋白（Titin, TTN）的截短突變是導致擴張型心肌病的重要原因，18%的散發(fā)性擴張型心肌病和25%的家族性擴張型心肌病是由TTN基因突變引起的[11]。Hinson等[12]通過提取擴張型心肌病患者的外周血樣本單核細胞，在體外加入Yamanaka因子誘導得到iPSC；同時提取正常人外周血單核細胞誘導得到iPSC，并利用Crispa-Cas9技術定點進行TTNtvs截短突變，通過病毒載體導入，利用Cas9作為核酸內(nèi)切酶在sgRNA （short guide RNA） 引導下在DNA分子中進行剪切。將兩種來源的iPSC誘導分化形成心肌細胞并構建心臟微組織。通過對其組織收縮力等心肌表型進行檢測，發(fā)現(xiàn)含有截短突變的心臟微組織收縮力明顯下降，心肌組織肌小節(jié)分布紊亂。對攜帶突變的心臟微組織進行牽拉刺激和異丙腎上腺素刺激，與對照組相比，突變組的收縮力也明顯下降，表明TTN突變導致異常的心肌應激反應。轉(zhuǎn)錄組學分析發(fā)現(xiàn)，突變型細胞中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、纖維母細胞生長因子（FGF ）、上表皮生長因素（EGF）等生長因子表達下調(diào)，miR-1、miR-16和miR-124表達上調(diào)。研究表明TTN截短突變是導致擴張型心肌病發(fā)生的原因，其可能通過降低部分生長因子表達水平，及心肌相關miRNA上調(diào)導致疾病的發(fā)生。在體外構建攜帶致病突變的iPSC，使得能夠在細胞水平檢測相關因子的變化，為闡述該致病機制提供參考。

1.2 iPSC與致心律失常性右心室心肌病

致心律失常性右心室心肌病是一種橋粒蛋白突變相關的遺傳性疾病，其特征主要表現(xiàn)在右心室局灶性纖維脂肪替代及心肌細胞缺失并伴有室性心率失常，是導致青年人及運動員猝死的重要原因之一[13]。超過50%患者攜帶橋粒蛋白基因的突變，最普遍的就是plakophilin-2 （PKP2）基因突變[14]。該病致病機制尚未闡明，主要原因有以下三方面：（1）由于致心律失常性右心室心肌病是慢性進展性疾病，因此從早期獲得該病的心臟樣本幾乎是無法實現(xiàn)的；（2）對該病患者進行心臟組織活檢有心臟穿孔的風險，極大地限制了心肌樣本的獲?。唬?）該病動物模型病理特征與人有較大差異，其中最為顯著的是極少有脂肪浸潤[15]。iPSC技術很好地解決了這些難題，Kim等[16]將致心律失常性右心室心肌病患者（攜帶有橋?；騊KP2致病突變）的成纖維細胞重編程為心肌細胞。研究發(fā)現(xiàn)，誘導分化的心肌細胞表面橋?；虮磉_下調(diào)，但并沒有出現(xiàn)明顯的脂肪形成或細胞凋亡。為了誘導其產(chǎn)生類似于人體的致心律失常性右心室心肌病特征性病理表型，研究者在心肌細胞中加入3F因子（包括胰島素，地塞米松，異丁甲基黃嘌呤），觀察到不顯著的脂肪形成和微弱的細胞凋亡；嘗試加入5F因子（包括胰島素，地塞米松，異丁甲基黃嘌呤，羅格列酮，吲哚美辛）后，發(fā)現(xiàn)心肌細胞出現(xiàn)明顯的脂肪形成和細胞凋亡。分析顯示PPAR-γ表達上調(diào)并檢測到其在核內(nèi)異常的印記。因此推測PPAR-γ在形成致心律失常性右心室心肌病病理表型中發(fā)揮重要的作用。研究者進一步實驗證實加入PPAR-γ激動劑可致心肌細胞在體外發(fā)生顯著脂肪形成和細胞凋亡，從而揭示了PKP2突變導致致心律失常性右心室心肌病的致病機制。體外構建的基于患者遺傳背景的iPSC模型能夠模擬致心律失常性右心室心肌病病理特征，并通過功能學研究探索出相關致病機制。

1.3 iPSC與肥厚型心肌病

肥厚型心肌病顯著病理特征是不明原因的左心室肥大，舒張期功能障礙，間質(zhì)纖維性增加，肌纖維紊亂，同樣可以導致心源性猝死或終末期心力衰竭[17]。肥厚型心肌病患者致病基因的發(fā)現(xiàn)加深了對于致病機理認識[18]，但是肥厚型心肌病如何在不同基因突變下產(chǎn)生表型仍然未知[19]。Tanaka等[20]利用患者來源的iPSC誘導得到心肌細胞，致力于發(fā)現(xiàn)導致肥厚型心肌病表型的共同通路。與不攜帶致病突變的野生型相比，攜帶突變的心肌細胞并未表現(xiàn)出明顯病理形態(tài)學特征型。然而內(nèi)皮素-1 （ET-1） 能加速心肌肥大，導致細胞纖維紊亂。進一步研究揭示ET-1主要促進活化T細胞核因子（NFAT）在核內(nèi)集聚從而促進形成肥厚型心肌病表型。該項研究結(jié)果表明患者遺傳背景、環(huán)境因素以及ET-1共同促進重編程心肌細胞產(chǎn)生肥厚型心肌病表型，這對于解析致病機制以及基因突變所致下游調(diào)控網(wǎng)絡提供了重要的理論支持。

1.4 iPSC應用于心肌病基礎研究的局限性

然而，需要指出的是iPSC誘導效率較低，鼠的iPSC誘導效率約為0.1%，而人iPSC誘導效率僅在0.01%左右，目前通過修改轉(zhuǎn)錄因子，加入microRNAs，小分子物質(zhì)等可將iPSC的誘導效率提高2～5倍[21]。但是iPSC誘導效率低仍是制約iPSC技術應用于基礎研究的一大瓶頸。另一方面iPSC誘導分化所得到的心肌細胞通常在形態(tài)及生理功能方面都表現(xiàn)為胚胎期細胞未成熟狀態(tài)而不是成熟心肌細胞表型[22]。因此由于結(jié)構和功能上與成熟心肌細胞之間的差異，在體外以iPSC誘導得到心肌細胞作為疾病模型的可靠性有待考究[16]。

2 iPSC與心肌病臨床研究

iPSC技術極大地促進了疾病診斷及再生醫(yī)學的發(fā)展[23]，同時為心肌病的治療提供了新的視野，并能在個體疾病水平上進行研究。Ye等[24]以患有心肌梗死的豬為模型，移植人源性iPSC誘導分化的心肌細胞，研究結(jié)果表明，注射在心肌梗死與正常組織交界區(qū)的人源性iPSC誘導分化的心肌細胞產(chǎn)生完整的肌節(jié)結(jié)構，并行使相應的功能。細胞移植顯著減小了心肌梗死區(qū)面積，減輕了心室壁的壓力，并且增強了心肌代謝，改善了左心室功能。Zhang等[25]利用人源性心肌成纖維細胞制備iPSC并誘導分化為心肌細胞，且將后者移植到小鼠心肌梗死交界區(qū)。在4周后，細胞凋亡減少，左心室收縮力明顯增強，心肌梗死癥狀明顯減輕。這些研究提示，人源性iPSC有希望于參與心臟損傷后的心肌修復。Shiba等[26]利用猴源成纖維細胞制備iPSC并誘導分化為心肌細胞，該心肌細胞為HT4單體型，將其移植到HT4雜合型猴子心肌梗死交界區(qū)。在12周內(nèi)，未見到明顯的免疫排斥，且在移植后4～12周，心臟收縮功能明顯改善。

來自患者iPSC作為重要的心肌病藥物篩選模型在肥厚型心肌病、擴張型心肌病等心肌病治療藥物的篩選取得了重大進展[27]。研究表明， iPSC源性的心肌細胞模型在心肌病藥物研究中的重要作用并為進一步的臨床試驗提供數(shù)據(jù)支持。

盡管iPSC對于再生醫(yī)學的發(fā)展具有重大意義，但是這項技術應用于臨床治療還有很多問題需要解決，如誘導效率低下，滿足不了臨床治療的細胞數(shù)量。研究表明，將iPSC源性心肌細胞在未純化的狀態(tài)下移植到小鼠心肌梗死的交界區(qū)，在一周后左心室出現(xiàn)團塊，隨后該團塊增長，免疫組化分析該團塊為畸胎瘤[28]。這在很大程度上限制了這項技術在臨床上的應用。此外，移植的iPSC源性心肌細胞與自體的心肌細胞整合程度不高，移植后的動物易出現(xiàn)心律失常[26]。因此，安全性問題也同樣掣肘iPSC應用于臨床。

3 展望

iPSC技術為在體外研究疾病的分子病理機制提供了獨特的方法。在過去幾年，iPSC已應用于多種心肌病的研究，構建了多種心肌病體外iPSC模型，從而進行遺傳變異與疾病表型相互作用的分析，獲得對于心肌病的新見解。將iPSC技術與基因編輯，全基因組技術等相結(jié)合是未來的發(fā)展方向，將使得iPSC成為生物醫(yī)學研究一個必不可少的工具。

目前iPSC技術在人心肌病治療中還未應用于臨床。對心肌病的治療可能主要集中在兩方面：一方面，減輕心肌損傷和左心室的擴張；另一方面，改善慢性心力衰竭患者心臟收縮能力。iPSC被認為是生物醫(yī)學領域的重要資源，可作為研究疾病致病機制的細胞模型，并進一步提供突變導致患者產(chǎn)生特殊疾病表型的功能驗證，以及評估疾病治療效果并為個體化醫(yī)療提供依據(jù)[29,30]。因此，iPSC技術對心肌病基礎研究與臨床治療都具有深遠意義。盡管iPSC應用仍存在限制，然而iPSC在基因水平上為心肌病研究提供了個體化治療的事實依據(jù)。

隨著iPSC在疾病模型，藥物篩選，細胞治療等研究方面的快速發(fā)展與應用，iPSC將提供導致疾病發(fā)生的更全面的基礎與臨床信息。在不久的將來，iPSC將更進一步地參與心肌病的轉(zhuǎn)化醫(yī)學應用。

[1] Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006, 126: 663-676.

[2] Aoi T, Yae K, Nakagawa M, et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science, 2008, 321: 699-702.

[3] Maron BJ, Towbin JA, Thiene G, et al. Contemporary definitions and classification of the cardiomyopathies: an American Heart Association Scientific Statement from the Council on Clinical Cardiology, Heart Failure and Transplantation Committee; Quality of Care and OutcomesResearch and Functional Genomics and Translational Biology Interdisciplinary Working Groups; and Council on Epidemiology and Prevention. Circulation, 2006, 113: 1807-1816.

[4] Nishizawa M, Chonabayashi K, Nomura M, et al. Epigenetic variation between human induced pluripotent stem cell lines is an indicator of differentiation capacity. Cell Stem Cell, 2016, 19: 341-354.

[5] Drews K, Jozefczuk J, Prigione A, et al. Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications. J Mol Med (Berl), 2012, 90: 735-745.

[6] Kang R, Zhou Y, Tan S, et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Res Ther, 2015, 6: 144.

[7] Sadahiro T, Yamanaka S, Ieda M. Direct cardiac reprogramming: progress and challenges in basic biology and clinical applications. Circulation Research, 2015, 116: 1378-1391.

[8] Disease GBD, Injury I, Prevalence C. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 310 diseases and injuries, 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet, 2016, 388: 1545-1602.

[9] Franz WM, Muller OJ, Katus HA. Cardiomyopathies: from genetics to the prospect of treatment. Lancet, 2001, 358: 1627-1637.

[10] Hershberger RE, Hedges DJ, Morales A. Dilated cardiomyopathy: the complexity of a diverse genetic architecture. Nat Rev Cardiol, 2013, 10: 531-547.

[11] Herman DS, Lam L, Taylor MR, et al. Truncations of titin causing dilated cardiomyopathy. N Engl J Med, 2012, 366: 619-628.

[12] Hinson JT, Chopra A, Nafissi N, et al. HEART DISEASE. Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy. Science, 2015, 349: 982-986.

[13] Calkins H, Marcus F. Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy/dysplasia: an update. Curr Cardiol Rep , 2008, 10: 367-375.

[14] Awad MM, Calkins H, Judge DP. Mechanisms of disease: molecular genetics of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy. Nat Clin Pract Cardiovasc Med, 2008, 5: 258-267.

[15] Zhang Z, Stroud MJ, Zhang J, et al. Normalization of Naxos plakoglobin levels restores cardiac function in mice. J Clin Invest , 2015, 125: 1708-1712.

[16] Kim C, Wong J, Wen J, et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature, 2013, 494: 105-110.

[17] Gersh BJ, Maron BJ, Bonow RO, et al. 2011 ACCF/AHA guideline for the diagnosis and treatment of hypertrophic cardiomyopathy: executive summary: a report of the American College of Cardiology Foundation/ American Heart Association Task Force on Practice Guidelines. Circulation , 2011, 124: 2761-2796.

[18] Ashrafian H, McKenna WJ, Watkins H. Disease pathways and novel therapeutic targets in hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Research , 2011, 109: 86-96.

[19] Marian AJ. Pathogenesis of diverse clinical and pathological phenotypes in hypertrophic cardiomyopathy. Lancet, 2000, 355: 58-60.

[20] Tanaka A, Yuasa S, Mearini G, et al. Endothelin-1 induces myofibrillar disarray and contractile vector variability in hypertrophic cardiomyopathy-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Am Heart Assoc , 2014, 3: e001263.

[21] Huangfu D, Maehr R, Guo W, et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nature Biotechnology , 2008, 26: 795-797.

[22] Lee DS, Chen JH, Lundy DJ, et al. Defined microRNAs induce aspects of maturation in mouse and human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes. Cell Rep, 2015, 12: 1960-1967.

[23] Prowse AB, Timmins NE, Yau TM, et al. Transforming the promise of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to a therapy: challenges and solutions for clinical trials. Can J Cardiol, 2014, 30: 1335-1349.

[24] Ye L, Chang YH, Xiong Q, et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cellderived cardiovascular cells. Cell Stem Cell , 2014, 15: 750-761.

[25] Zhang L, Guo J, Zhang P, et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circulation Heart Failure, 2015, 8: 156-166.

[26] Shiba Y, Gomibuchi T, Seto T, et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature , 2016, 538: 388-391.

[27] Han L, Li Y, Tchao J, et al. Study familial hypertrophic cardiomyopathy using patient-specific induced pluripotent stem cells. Cardiovascular Research , 2014, 104: 258-269.

[28] Ban K, Wile B, Kim S, et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons that target cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation, 2013, 128: 1897-1909.

[29] 胡士軍, 雷偉, Joseph Wu. iPSC心臟轉(zhuǎn)化應用前的關鍵問題研究.中國循環(huán)雜志, 2015 , 30（增1）: 24.

[30] 魏巍, 張薔, 王恩世, 等. 利用疾病誘導多能干細胞進行肥厚性心肌病心臟停搏液個體化選擇 . 中國循環(huán)雜志, 2015, 30（增1）: 24-25.

2016-11-21）

(編輯:汪碧蓉)

CIFMS （2016-I2M-1-015）；國家自然科學基金 （NO 81670376）；PUMC青年基金；中央高校基本科研業(yè)務費基金

100037 北京市，北京協(xié)和醫(yī)學院 中國醫(yī)學科學院 國家心血管病中心 阜外醫(yī)院 心血管疾病國家重點實驗室 心血管外科

李萌萌 碩士研究生 主要從事心肌病研究 Email:fw_lmm@163.com 通訊作者：宋江平 Email:fwsongjiangping@126.com

R541

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1000-3614（2017）09-0934-03

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.09.026