整合REV LTR的自然重組馬立克氏病毒GX0101的全基因組序列分析

周忠文，蘇 帥*，崔 寧，孫 鵬，孫淑紅，崔治中

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271018；2.山東省農(nóng)科院，濟(jì)南 250100)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.10.01

整合REV LTR的自然重組馬立克氏病毒GX0101的全基因組序列分析

周忠文1，蘇 帥1*，崔 寧2，孫 鵬1，孫淑紅1，崔治中1

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271018；2.山東省農(nóng)科院，濟(jì)南 250100)

GX0101是一株整合禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒 (REV) 長(zhǎng)末端重復(fù)序列 (LTR) 的重組馬立克氏病病毒 (MDV)。基于MDV GX0101的細(xì)菌人工染色體感染性克隆利用高通量測(cè)序技術(shù)完成了對(duì)其全基因組的序列分析。GX0101全基因組長(zhǎng)178101 bp, 其基因組的TRL、UL、IRL、IRS、US和TRS區(qū)分別長(zhǎng)12758 bp、113572 bp、12741 bp、12700 bp、11695 bp、13134 bp。與Md5不同，GX0101含有一個(gè)sorf2基因。同時(shí)，GX0101全基因組含有一個(gè)REV LTR重組片段，位于其基因組US區(qū)的sorf1中，sorf2基因前267 bp堿基處。通過(guò)與已發(fā)表的近10株MDV的比較, 發(fā)現(xiàn)GX0101與英國(guó)分離株C12/130的兩個(gè)不同毒力的感染性克隆pC12/130-10和pC12/130-15同源性最高。GX0101的全基因組序列的比較分析，有助于進(jìn)一步闡明MDV致病性、傳播性相關(guān)的基因，也有助于揭示不同地域間MDV的遺傳變異和演化關(guān)系。

REV LTR；重組MDV；感染性克??；高通量測(cè)序；全基因組

馬立克氏病是由馬立克氏病毒(Marek's disease virus, MDV)引起的雞的腫瘤病，可以通過(guò)空氣、雞只的相互接觸傳播[1-2]。MDV屬于a皰疹病毒，分為3個(gè)血清型，一般認(rèn)為血清Ⅰ型病毒有致病性，可引起T細(xì)胞淋巴瘤以及其他病變。血清Ⅱ型與Ⅲ型病毒沒(méi)有致病性[3-4]。雖然三個(gè)血清型基因組結(jié)構(gòu)相似，都是由線性雙股DNA組成，但是基因組成上差別很大，與MD致病性相關(guān)的基因至今還不是十分明確[5-7]。

GX0101是在中國(guó)廣西省分離到一株自然重組進(jìn)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(Reticuloendothe￣liosis virus, REV)長(zhǎng)末端重復(fù)序列(Long terminal repeat, LTR)的重組MDV，屬于MDV超強(qiáng)毒，毒力強(qiáng)于MDV強(qiáng)毒國(guó)際參考株GA株，弱于MDV超強(qiáng)毒國(guó)際參考株Md5株，但是橫向傳播能力強(qiáng)于Md5株[8-10]。利用細(xì)菌人工染色體技術(shù)構(gòu)建GX0101的感性克隆，敲除GX0101基因組的 REV LTR片段，證實(shí)REV LTR片段的插入顯著提高GX0101的橫向傳播能力[11-12]。敲除GX0101的致腫瘤基因meq后，GX0101Δmeq完全喪失致病性，并且能夠提供比MDV商品化疫苗CVI988/Rispens更好的保護(hù)效果[13-14]。與缺失meq基因的重組MDV rMd5Δmeq不同，GX0101Δmeq喪失免疫抑制并且在雞體內(nèi)能夠穩(wěn)定的復(fù)制。RM1是由MDV與REV在細(xì)胞上共培養(yǎng)產(chǎn)生的含有REV LTR片段的重組MDV，其毒力已被致弱，對(duì)雞沒(méi)有致腫瘤性，而GX0101屬于超強(qiáng)毒，具有較高的致腫瘤率[15-16]。為了進(jìn)一步分析引起MDV生物學(xué)活性差異相關(guān)的基因，本文利用高通量測(cè)序技術(shù)完成了對(duì)MDV GX0101的細(xì)菌人工染色體感染性克隆全基因組的序列分析。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及病毒來(lái)源 9～10日齡SPF雞胚購(gòu)自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司，實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法制備成雞胚層纖維細(xì)胞(Chicken embryo fibroblasts, CEF)。MDV GX0101由本實(shí)驗(yàn)室在中國(guó)廣西省分離[8]，GX0101感染性克隆GX0101-BAC由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存[11]。

1.2 主要試劑 高保真Taq酶(包括PCR反應(yīng)所需buffer)、dNTP、常用限制性內(nèi)切酶、pMD18-T連接試劑盒等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；凝膠回收試劑盒(D2500-01)、質(zhì)粒提取試劑盒(D6943-01)均購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；Trans2K DNA Marker、Trans15K DNA Marker購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。MDV BAC質(zhì)粒大量提取試劑盒(Plasmid Maxi Kit)購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司。

1.3 GX0101感染性克隆GX0101-BAC質(zhì)粒的制備

按照QIAGEN Plasmid maxi kit (Cat. No.12163) 操作說(shuō)明大量制備含有GX0101全基因組的感染性克隆GX0101-BAC質(zhì)粒，操作保證質(zhì)粒DNA的完整性。

1.4 GX0101感染性克隆GX0101-BAC的測(cè)序 將40.0 μg的GX0101-BAC(200 ng/μL)由基于焦磷酸測(cè)序原理的Genome Sequencer 20 FLX System (454 Life Science Corporation)平臺(tái)進(jìn)行商業(yè)化測(cè)序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。具體試驗(yàn)流程如下：首先通過(guò)高壓氮?dú)鈱⒒蚪M霧化成約300～800 bp的片段，然后利用T4 DNA聚合酶和T4核苷酸激酶在DNA片斷的5'端加上磷酸基團(tuán)，3'端變成平端，分別和長(zhǎng)44個(gè)堿基銜接子(adaptor)進(jìn)行平端連接。將分離到的含有銜接子的DNA片段與磁珠結(jié)合，每一個(gè)磁珠都被油水混合的小滴包被，因此可以獨(dú)立的進(jìn)行一個(gè)片段的擴(kuò)增，而沒(méi)有其他片段擴(kuò)增的影響。經(jīng)過(guò)這種平行擴(kuò)增后，每個(gè)磁珠都有成千上萬(wàn)個(gè)相同的基因拷貝。將磁珠富集后加入40×75 mm PicoTiter Plate 板進(jìn)行測(cè)序。

對(duì)于重復(fù)序列以及其他不確定序列的驗(yàn)證均由多次單獨(dú)的PCR克隆測(cè)序驗(yàn)證。PCR以親本病毒GX0101感染的CEF細(xì)胞DNA為模板，PCR產(chǎn)物均連接到pMD18-T(大連寶生物工程有限公司)載體由ABI-3730 XL DNA Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA)測(cè)序分析。

1.5 GX0101的全基因組序列分析 利用DNASTAR、NCBI上的blastP和PsiBlast、MultAlin、MEGA 3.1等其他工具對(duì)GX0101基因組序列進(jìn)行分析。用于同GX0101進(jìn)行基因組比對(duì)的其他MDV毒株(Md5、814、PC12/130-10、PC12/130-15、CVI988、GA、RB1B)基因組序列均由NCBI獲取。

2 結(jié) 果

2.1 GX0101的基因組結(jié)構(gòu)以及與其他不同株MDV的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系 GX0101全基因組的拼接來(lái)自Genome Sequencer 20 FLX System 平臺(tái)的13596個(gè)讀長(zhǎng)(平均每個(gè)長(zhǎng)378 bp)，最終的測(cè)序深度是28倍。GX0101全基因組長(zhǎng)178101bp (GeneBank NO. JX844666)，包括構(gòu)建GX0101感染性克隆缺失的部分US2基因的序列(以親本病毒GX0101感染的CEF細(xì)胞DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序后補(bǔ)齊)，堿基組成的鳥嘌呤和胞嘧啶(G+C)占44%。整個(gè)基因組由長(zhǎng)末端重復(fù)區(qū)(terminal repeat long region，TRL)、長(zhǎng)獨(dú)特區(qū)(unique long region, UL)、內(nèi)部長(zhǎng)重復(fù)區(qū)(internal repeat long region, IRL)、內(nèi)部短重復(fù)區(qū)(internal repeat short region, IRS)、短獨(dú)特區(qū)(unique short region, US)和短末端重復(fù)區(qū)(terminal repeat short region, TRS)組成。其中，長(zhǎng)末端重復(fù)區(qū)長(zhǎng)12758 bp，在基因組位于1#～12758#；長(zhǎng)獨(dú)特區(qū)長(zhǎng)113572 bp，位于12759#～126330#；內(nèi)部長(zhǎng)重復(fù)區(qū)長(zhǎng)12741 bp，位于126331#～139071#；內(nèi)部短重復(fù)區(qū)長(zhǎng)12700 bp，位于139833#～152532#；短獨(dú)特區(qū)長(zhǎng)11695 bp，位于152533#～164227#；短末端重復(fù)區(qū)長(zhǎng)13134 bp，位于164228#～177361#，包括近200個(gè)開放閱讀框，2個(gè)拷貝的132 bp的重復(fù)片段。GX0101與其他毒株基因組不同區(qū)域的比較見表1 (其中IRL/IRS和TRS區(qū)為了比較的方便加入了基因組中的α序列)。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，GX0101與來(lái)自英國(guó)的超強(qiáng)毒C12/130的兩個(gè)不同致病性的感染性克隆pC12/130-10和pC12/130-15具有比較近的進(jìn)化關(guān)系。584Ap80是將特超強(qiáng)毒584A在細(xì)胞傳80代，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)明確證實(shí)毒力致弱的病毒，與GX0101也有比較近的進(jìn)化關(guān)系(圖1)。

In order to define and characterize the repeat regions in the GX0101 genome, the sequences and copy numbers of the 132 bp repeats in each long repeat (TRL and IRL) and the a-like sequences at the IRL/IRS and TRS/TRL junctions needed to be determined. m: mild; v: virulent; vv: very virulent; vv+: very virulent plus. a: Sequences of BAC constructs. b: Length includes 616 bp of the US2 gene missing in the BAC construct. c: Length includes 813 bp of the US2 gene missing in the BAC construct. d: Calculated length includes 1207 bp of the gD gene missing in the BAC construct. e: Md11 BAC construct contains a large deletion in the TRS region. This number represents an estimation of the length. f: The a-like sequence was not determined for the sequence in GenBank.

2.2 GX0101的基因組中的REV LTR重組片段 通過(guò)全基因組測(cè)序，證實(shí)GX0101全基因組中僅含有一個(gè)長(zhǎng)538 bp的REV LTR片段，位于基因組短獨(dú)特區(qū)sorf2基因上游267 bp的sorf1基因中(圖2)。REV LTR整合片段位于GX0101基因組的152721#～153258#堿基位點(diǎn)(相當(dāng)于Md5的153175#～153176#)。與細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中REV與MDV共感染產(chǎn)生的重組MDV RM1不同，RM1中的REV LTR片段位于其基因組IRS區(qū)，在其基因組中sorf1上游832 bp處，sorf2基因上游1163 bp處(相當(dāng)于GX0101基因組的151736#～151737#)。RM1隨著在細(xì)胞上傳代，在其基因組的TRS區(qū)插入另一相同的REV LTR片段。相比，GX0101整合的REV-LTR具有良好的穩(wěn)定性，經(jīng)過(guò)在細(xì)胞、雞體內(nèi)多次傳代依然保持唯一性。

2.3 GX0101與其他MDV毒株相比基因組中的缺失片段 pC12/130-10與pC12/130-15是來(lái)自MDV超強(qiáng)毒C12/130的兩個(gè)感染性克隆，通過(guò)兩個(gè)感染性克隆的全基因組比較，發(fā)現(xiàn)pC12/130-10的71.4～72.2開放閱讀框有一增加的494 bp的堿基，其他I型MDV毒株無(wú)論疫苗株還是致病株都沒(méi)有這一片段。GX0101作為超強(qiáng)毒其基因組也沒(méi)有這一494 bp的片段(圖3)，但是在這一71.4～72.2開放閱讀框間的序列與pC12/130-15存在100%的同源性，其他均沒(méi)有如此高的同源性。

GX0101基因組的US區(qū)(相對(duì)于Md5的164032#～164519#處)與 Md5、Md11、RB1B、CU2、584A、CVI988/Rispens毒株相比缺少486 bp堿基(圖4)，但是與GA、814、pC12/130-10、pC12/130-15等毒株一樣，并且通過(guò)同源性比較發(fā)現(xiàn)這一缺失區(qū)兩端序列與pC12/130-10、pC12/130-15具有100%同源性。雖然這一缺失與病毒致病性的相關(guān)性還不明確，但是可以推測(cè)這種獨(dú)特的基因組結(jié)構(gòu)使得sorf1基因完全位于基因組的US區(qū)。自然重組的REV-LTR之所以能夠穩(wěn)定的插入這一位點(diǎn)，而并沒(méi)有隨著病毒復(fù)制產(chǎn)生另一REV LTR片段，依然保持良好的穩(wěn)定性，與這一獨(dú)特結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

GX0101 US區(qū)與TRS區(qū)連接處與GA、814、pC12/130-10、pC12/130-15等毒株一樣，與Md5相比缺少830 bp堿基(圖5)，但是GX0101、pC12/130-10屬于超強(qiáng)毒，GA屬于強(qiáng)毒，pC12/130-15屬于弱毒，而814株屬于疫苗毒，因此這種堿基的缺失與病毒致病性以及穩(wěn)定性間的關(guān)系將是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。盡管RB1B、CU2、584A、CVI988/Rispens毒株與Md5相比也有堿基的缺失，但是可以看出這五株MDV的缺失顯然與GX0101、GA、814等五株不同。

2.4 GX0101與其他MDV毒株相比基因組中的增加片段 GX0101基因組中TRS區(qū)的MDV97.3～97.6開放閱讀框中，有5個(gè)連續(xù)的217 bp堿基的重復(fù)，其他不同毒株雖然也含有不同拷貝數(shù)的重復(fù)，但是沒(méi)有GX0101數(shù)目多。同樣在GX0101基因組的IRS區(qū)的86.2～86.4開放閱讀框中，存在3個(gè)相同的217 bp的重復(fù)序列，其他MDV相比僅含有1～2拷貝的重復(fù)。

3 討 論

自2000年Lee等發(fā)表GA株I型MDV(MDV1)全基因組序列以來(lái)，已有10多株I型MDV完成了全基因組的序列比較、分析，它們分別屬于弱毒疫苗株、強(qiáng)毒、超強(qiáng)毒和特超強(qiáng)毒等不同的致病型[17-19]。GX0101作為自然重組MDV，其致病性、橫向傳播性以及相關(guān)基因片段的功能已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究[20-22]。為了進(jìn)一步分析GX0101基因組結(jié)構(gòu)，我們?cè)贕X0101的感染性克隆質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，利用高通量測(cè)序的方法完成了對(duì)其全基因組的測(cè)序分析(GeneBank NO. JX844666)，GX0101基因組全長(zhǎng)178101 bp，其基因組的TRL區(qū)、UL區(qū)、IRL區(qū)、IRS區(qū)、US區(qū)和TRS區(qū)分別長(zhǎng)12758 bp、113572 bp、12741 bp、12700 bp、11695 bp、13134 bp?；蚪M含有兩個(gè)拷貝的132 bp重復(fù)片段。

GX0101基因組中含有唯一的REV LTR插入片段位于US區(qū)sorf2基因上游267 bp的sorf1基因中。另一細(xì)胞培養(yǎng)上MDV與REV共感染產(chǎn)生的重組毒RM1中的REV LTR片段位于其基因組的IRS區(qū)，在其基因組中sorf1上游832 bp處，sorf2基因上游1163 bp處，并且隨著病毒的復(fù)制在其基因組的TRS區(qū)出現(xiàn)另外一REV LTR片段[15]。如果將RM1中的REV LTR片斷插入rMd5基因組中相似的位置，拯救的重組病毒在細(xì)胞培養(yǎng)上能夠穩(wěn)定遺傳但在雞體內(nèi)不能穩(wěn)定存在，在傳代過(guò)程中容易失去插入的REV LTR片段[23-24]。相反，GX0101在雞體內(nèi)即使經(jīng)過(guò)20代傳代其基因組中的REV LTR片段依然能夠穩(wěn)定存在。即使將ALV的LTR插入GX0101相同的位置，ALV LTR依然能夠在病毒的基因組中穩(wěn)定存在，隨著病毒在雞體內(nèi)的復(fù)制而復(fù)制[25]。從病毒基因組復(fù)制的角度思考，由于GX0101獨(dú)特的基因組結(jié)構(gòu)，sorf1基因位于其短獨(dú)特區(qū)，使得REV LTR整合進(jìn)sorf1基因后能夠穩(wěn)定存在，重組MDV GX0101具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。最終由于REV LTR重組片段的影響提高病毒的橫向傳播能力，使其具有一定的流行優(yōu)勢(shì)，在雞群中被分離出來(lái)。

GX0101株MDV與其他10株MDV的全基因組序列比較顯示出一個(gè)有趣的現(xiàn)象，即從中國(guó)分離到的GX0101與英國(guó)分離株C12/130株的兩個(gè)獨(dú)立的BAC克隆pC12/130-10 和pC12/130-15病毒序列的同源性最高[26-27]。除了GX0101具有這一特有的REV LTR插入片段外，在經(jīng)比較的190個(gè)ORFs (Open reading frames)中不同毒株間發(fā)生不同程度變異的有77個(gè)。在這77個(gè)ORFs中，GX0101與這兩個(gè)克隆呈100%同源的ORF分別有50個(gè)和47個(gè)，而與RB1B、Md5、GA、814和CVI988等毒株卻只有7～27個(gè)ORFs呈現(xiàn)100%同源性。pC12/130-10、pC12/130-15雖然是來(lái)自C12/130的兩個(gè)感染性克隆，但是致病性卻截然不同，pC12/130-10屬于超強(qiáng)毒，而pC12/130-15屬于弱毒。通過(guò)兩個(gè)感染性克隆的全基因組比較，發(fā)現(xiàn)pC12/130-10的71.4～72.2開放閱讀框有一增加的494 bp的基因片段，而GX0101等其他不同致病性MDV基因組沒(méi)有，為了繼續(xù)分析這一片段在MDV致病性的作用，我們將進(jìn)一步利用同源重組技術(shù)將其插入GX0101相似位置，分析重組病毒的復(fù)制能力、致病性等生物學(xué)活性。因此，對(duì)超強(qiáng)毒GX0101及pC12/130-10、pC12/130-15序列差異的比較為進(jìn)一步分析病毒的基因功能奠定基礎(chǔ)。

除此之外，在GX0101基因組TRS區(qū)的97.3～97.6開放閱讀框中有5個(gè)連續(xù)的217 bp重復(fù)片段，在IRS區(qū)的86.2～86.4開放閱讀框有3個(gè)重復(fù)的217 bp的重復(fù)片段，其余MDV無(wú)論在TRS區(qū)還是IRS區(qū)均沒(méi)有如此多的連續(xù)重復(fù)。雖然這段序列編碼的還只是其功能不清的一個(gè)“hypothetical protein”，但作為帶有最多拷貝數(shù)的毒株，進(jìn)一步分析該重復(fù)性片段與GX0101生物學(xué)特性間的關(guān)系的是有意義的。GX0101 US區(qū)與TRS區(qū)連接處與GA、814、pC12/130-10、pC12/130-15等毒株一樣，與Md5相比缺少830 bp，但GX0101、pC12/130-10屬于超強(qiáng)毒，GA屬于強(qiáng)毒，pC12/130-15屬于弱毒，而814株屬于疫苗毒，因此這種堿基的缺失與病毒致病性以及穩(wěn)定性間的關(guān)系將是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

鑒于GX0101在致病性、橫向傳播性及基因組結(jié)構(gòu)上的特性，對(duì)GX0101的全基因組序列的比較分析，既有助于闡明與MDV致病性、傳播性相關(guān)的基因，也有助于揭示不同地域間MDV的遺傳變異和演化關(guān)系。

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GenomicSequenceAnalysisofaFieldMarek'sDiseaseVirusStrainGX0101withaReticuloendotheliosisVirusTerminalRepeatLongInsert

ZHOU Zhong-wen1, SU Shuai1*, CUI Ning2, SUN Peng1, SUN Shu-hong1, CUI Zhi-zhong1

(1.AnimalScienceandTechnologyCollege,ShandongAgriculturalUniversity,Tai'an,Shandong271018,China; 2.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinary,ShandongAcademyofAgriculturalSciences,Jinan250100,China)

SUShuai,E-mail:ssu6307@163.com

GX0101 is a recombinant Marek's disease virus (MDV) field strain with one reticuloendotheliosis virus (REV) long terminal repeat (LTR) insert. Based on the purified plasmid DNA of GX0101 bacterial artificial chromosome (BAC) infectious clone, the complete genome of GX0101 was sequenced and analyzed using high throughput sequencing technology. The complete genome sequence of GX0101 is 178101 bp in length. The terminal repeat long (TRL), unique long (UL), internal repeat long (IRL), internal repeat short (IRS), unique short (US), and terminal repeat short (TRS) regions were 12758 bp, 113572 bp, 12741 bp, 12700 bp, 11695 bp and 13134 bp, respectively. The GX0101 genome contains only one sorf2 gene, which is different from Md5. GX0101 contains a REV LTR insert located in sorf1 gene of US region, at a site 267 bp upstream of the sorf2 gene in the genome. Among the 10 recently reported MDV strains, whole genome of GX0101 shows the highest identity to two BAC clones PC12130-10 and PC12130-15 of United Kingdom strain C12130 with different virulence. Analysis of the complete sequence of GX0101 will be useful on both studies of gene functions related to pathogenicity or transmission ability, and evolutionary relationships of MDVs in different geographical areas.

REV LTR; recombinant MDV; infectious clone; high throughput sequencing; complete genome

2017-06-29

A

1002-1280 (2017) 10-0001-10

S852.6

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31402235)

周忠文，碩士，從事分子病毒學(xué)研究。

蘇 帥。E-mail: ssu6307@163.com

(編輯：李文平)