初治涂陽肺結核患者治療前后結核分枝桿菌毒力變化的探討

李麗 馬記磊 任易 謝紅 田丹 南晶 俞琦 田茂鵬 景玉凱 范雄林 王衛(wèi)華

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·論著·

初治涂陽肺結核患者治療前后結核分枝桿菌毒力變化的探討

李麗 馬記磊 任易 謝紅 田丹 南晶 俞琦 田茂鵬 景玉凱 范雄林 王衛(wèi)華

目的 分析初治涂陽肺結核患者經(jīng)抗結核藥物治療前后結核分枝桿菌(MTB)的毒力變化情況。方法 收集2014—2015年入選“武漢市初治涂陽肺結核免費隔離治療項目”的患者中初治涂陽肺結核且經(jīng)抗結核治療2周后痰涂片仍未轉陰者(未轉陰組)治療前、治療1周后及治療2周后分離的MTB(15株)；初治涂陽肺結核經(jīng)抗結核藥物治療后2周內(nèi)痰涂片轉陰患者(轉陰組)治療前分離的MTB(4株)；耐多藥結核病患者(對照組)治療前分離的MTB(1株)。將上述不同類別患者不同時間點痰培養(yǎng)分離的MTB菌株于體外分別感染巨噬細胞3 h和96 h后，應用流式細胞術檢測巨噬細胞早期凋亡水平，同時計數(shù)菌落數(shù)量，分析其變化情況。結果 未轉陰組治療前、治療1周后、治療2周后分離的MTB菌株感染巨噬細胞3 h后，誘導巨噬細胞早期凋亡率分別為(2.95±1.13) %、(4.21±1.92) %、(3.73±1.36) %，差異無統(tǒng)計學意義(F=3.38，P=0.086)；感染巨噬細胞96 h后，誘導巨噬細胞早期凋亡率分別為(4.25±0.48) %、(5.69±2.03) %、(5.06±1.25) %，差異無統(tǒng)計學意義(F=1.69，P=0.245)。未轉陰組、轉陰組及對照組患者治療前痰培養(yǎng)分離的MTB菌株感染巨噬細胞3 h后誘導巨噬細胞早期凋亡率分別為(2.95±1.13) %、(4.05±1.87) %、(4.38±0.29) %，差異無統(tǒng)計學意義(F=1.94，P=0.380)；感染巨噬細胞96 h后，誘導巨噬細胞早期凋亡率分別為(4.25±0.48) %、(4.11±0.26) %、(5.39±0.24) %，差異有統(tǒng)計學意義(F=11.97，P=0.003)。各組不同治療時間所分離的MTB菌株感染巨噬細胞后菌落數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義。結論 初治涂陽肺結核經(jīng)抗結核治療后2周痰涂片仍未轉陰患者所攜帶的MTB菌株毒力在治療前后沒有變化。

結核, 肺； 分枝桿菌，結核； 毒力； 評價研究

結核病是三大傳染性疾病之一，結核分枝桿菌(MTB)是導致結核病的病原菌。宿主巨噬細胞凋亡可殺死寄生于其內(nèi)的MTB，阻止其在體內(nèi)播散，同時可有助于激活適應性免疫應答，因此，被認為有助于機體控制MTB的繁殖和播散[1]。低毒力MTB感染人體時，可促發(fā)免疫保護機制，誘導巨噬細胞的凋亡；而高毒力MTB則引起巨噬細胞的壞死?？梢姡煌玖TB菌株對宿主轉歸的影響完全不同[2]?；诖耍P者收集初治涂陽且經(jīng)抗結核藥物治療2周后痰菌未轉陰的肺結核患者治療前后不同時間點的MTB臨床分離株，抗結核藥物治療2周內(nèi)轉陰患者及耐多藥結核病患者治療前的MTB臨床分離株，比較各類菌株感染巨噬細胞后誘導巨噬細胞早期凋亡的水平及計數(shù)MTB菌株數(shù)量，研究MTB菌株的毒力是否有改變。

材料和方法

1.對象：選取2014—2015年入選“武漢市初治涂陽肺結核免費隔離治療項目”的患者作為研究對象。根據(jù)抗結核藥物治療2周后痰涂片鏡檢結果將患者分為兩類：抗結核藥物治療后2周痰涂片鏡檢仍未轉陰、且培養(yǎng)陽性的患者作為未轉陰組，共5例；抗結核藥物治療2周內(nèi)痰涂片鏡檢轉陰患者作為轉陰組，共4例。收集未轉陰組患者治療前、治療后1周及治療2周后痰培養(yǎng)分離的MTB菌株共15株；收集轉陰組患者治療前痰培養(yǎng)分離的MTB菌株共4株。篩選同時耐異煙肼和利福平的耐多藥結核病患者治療前痰培養(yǎng)分離的1株MTB作為對照。

2.儀器與試劑：Sigma 3K15離心機(購自德國Sigma公司)、BD Calibur流式細胞儀(購自美國BD公司)、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(購自南京凱基生物科技有限公司)、7H11瓊脂培養(yǎng)基(購自美國BD Pharmingen公司)、U937細胞(購自上海中國科學院細胞庫)、BSA-V牛血清白蛋白(購自安徽Biosharp公司)。

3.U937細胞培養(yǎng)：將1640+10%胎牛血清(FBS)培養(yǎng)基放入37 ℃水浴鍋內(nèi)復溫，打開紫外燈照射30 min；取生長48 h、狀態(tài)良好的U937細胞置于已經(jīng)準備好的生物安全柜中，吸取細胞懸液，加入到無菌的15 ml離心管內(nèi)，500×g離心5 min；棄上清，加入4 ml 1640+10%FBS完全培養(yǎng)基，吹打數(shù)次，使細胞均勻分散。按照1∶4的比例傳代，取1 ml 細胞懸液和4 ml 1640+10%FBS完全培養(yǎng)基，加入到新的培養(yǎng)瓶中，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使細胞均勻分布；做好標記，把培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

4.細菌培養(yǎng)：打開生物安全柜內(nèi)紫外燈照射30 min，取-40 ℃保存的MTB菌種各100 μl，加入至新鮮配制的7H11平板中，輕輕搖晃平板使菌液均勻分布，做好相應標記，用封口膠封口，放置37 ℃溫箱中培養(yǎng)3周左右。7H11培養(yǎng)基制備采用7H11 Broth(肉湯)21 g，甘油5 ml加雙蒸水溶解，定容至900 ml，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，待溫度降至55 ℃，將牛血清白蛋白-葡萄糖-過氧化氫酶(ADC)和7H11瓊脂溶液按照1∶9比例配置混勻，分裝至無菌的培養(yǎng)皿，凝固后分裝備用。

5.細菌懸液制備：打開生物安全柜內(nèi)紫外燈照射30 min，挑取7H11平板上生長的菌落，置于無菌已稱量過的Eppendorf(EP)管中，稱量EP管中不同細菌的重量，按照干重1 mg細菌所含的細菌個數(shù)為1×107計算細菌總數(shù)，把EP管中的細菌轉移至勻漿器，加入一定量的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)，研磨細菌，使細菌均勻分散。

6.細菌感染細胞：按照細菌感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)值為10感染U937細胞，4 h 后吸取細胞懸液加入到15 ml離心管中，500×g離心5 min，加入5 ml PBS重懸細胞，反復離心洗滌5次，充分去除細胞外未感染細胞的細菌，加入2 ml的新鮮完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

7.巨噬細胞荷菌量分析：細菌分別感染巨噬細胞3 h和96 h，收集細胞：500×g離心5 min，收集U937細胞，PBS緩沖液重懸細胞，洗滌3次，用1 ml PBS 重懸細胞；其中500 μl 用于菌落計數(shù)，剩余500 μl 用于流式分析細胞凋亡和死亡。吸取100～900 μl無菌1×PBS緩沖液，并依此進行倍比稀釋至10-4梯度；從各個梯度稀釋液中吸取100 μl液體加至制備好的7H11瓊脂培養(yǎng)基三格平板的每個格子中，并做好標記；將涂布完成的平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中，待液體吸收完全后倒置培養(yǎng)3周。3周后記錄每個平板上菌落數(shù)量。根據(jù)稀釋度換算得到每個孔中所包含的菌落總數(shù)。每孔巨噬細胞荷菌量以log10菌落形成單位(CFU)表示。

8.巨噬細胞凋亡和壞死檢測：收集未轉陰組患者治療前、治療后1周及治療后2周痰培養(yǎng)分離的MTB，按照細菌MOI值為10感染U937細胞3 h和96 h，利用凋亡檢測試劑盒進行染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡水平并利用FlowJo軟件進行分析。500×g離心5 min，收集5×105個上述經(jīng)PBS洗滌的巨噬細胞；每管加入500 μl的結合緩沖液(binding buffer)重懸細胞；加入5 μl膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexin V-FITC)，充分混勻，加入5 μl 碘化丙碇(propidium iodide，PI)，混勻；室溫、避光、放置5～15 min，annexin V-FITC/PI染色，1 h內(nèi)應用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，應用Cellquest軟件獲取數(shù)據(jù)。根據(jù)實驗原理，annexin V單陽性為早期凋亡細胞，annexin V和PI雙陽性者為晚期凋亡及壞死細胞，雙陰性者為活細胞。

9. 統(tǒng)計學分析：采用SPSS 18.0軟件進行分析，未轉陰組患者不同治療時間分離MTB感染巨噬細胞后細胞早期凋亡率的組間比較采用配對t檢驗，以P<0.025為差異有統(tǒng)計學意義。不同組別患者治療前分離MTB菌株感染巨噬細胞后細胞早期凋亡率的比較采用方差分析。菌落計數(shù)的比較采用非參數(shù)檢驗Kruskal-Wallis檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.MTB誘導巨噬細胞凋亡水平：未轉陰組治療前痰培養(yǎng)分離MTB感染3 h后，誘導巨噬細胞早期凋亡率為(2.95±1.13) %，治療1周后痰培養(yǎng)分離MTB誘導巨噬細胞早期凋亡率為(4.21±1.92) %，治療2周后痰培養(yǎng)分離MTB誘導巨噬細胞早期凋亡率為(3.73±1.36) %。治療前、治療1周后、治療2周后分離菌株誘導巨噬細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義。未轉陰組治療前痰培養(yǎng)分離MTB感染96 h后，誘導巨噬細胞早期凋亡率為(4.25±0.48) %，治療1周后誘導巨噬細胞早期凋亡率為(5.69±2.03) %，治療2周后誘導巨噬細胞早期凋亡率為(5.06±1.25) %。治療前、治療1周后、治療2周后分離菌株誘導巨噬細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義。治療前、治療1周后、治療2周后分離菌株，分別感染巨噬細胞不同時間(3、96 h)誘導巨噬細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(表1)。

比較未轉陰組、轉陰組及對照組患者治療前痰培養(yǎng)分離MTB感染巨噬細胞3 h和96 h后誘導巨噬細胞早期凋亡水平。MTB感染巨噬細胞3 h后，未轉陰組、轉陰組、對照組分離MTB誘導巨噬細胞早期凋亡水平差異無統(tǒng)計學意義。感染巨噬細胞96 h后，未轉陰組、轉陰組、對照組分離MTB誘導巨噬細胞早期凋亡水平差異有統(tǒng)計學意義，但未轉陰組與轉陰組相比誘導巨噬細胞早期凋亡水平差異無統(tǒng)計學意義(表2)。

2.MTB感染巨噬細胞后菌落數(shù)量變化情況：MTB感染巨噬細胞3 h和96 h后，去除細胞繼續(xù)培養(yǎng)MTB 3周后，記錄每個平板上菌落數(shù)量。根據(jù)稀釋度換算得到每個孔中每毫升菌液所包含的菌落總數(shù)[lg(CFU)]。結果發(fā)現(xiàn)，未轉陰組患者治療前分離MTB初始感染巨噬細胞菌量為7.01±0.37、感染3 h后菌量為5.75±0.30、感染96 h后菌量為6.75±0.34；治療1周后初始感染菌量為7.10±0.29、感染3 h后菌量為5.81±0.50、感染96 h后菌量為6.82±0.43；治療2周后初始感染菌量為7.02±0.31、感染3 h后菌量為5.70±0.34、感染96 h后菌量為6.70±0.34。對未轉陰組治療前、治療后1周及治療后2周菌量進行Kruskal-Wallis檢驗，結果顯示感染不同時間點，治療前、治療后1周、治療后2周組間差異無統(tǒng)計學意義(K-W值=0.62，P=0.733)。

表1 未轉陰組患者不同治療時間MTB分離株感染巨噬細胞后細胞早期凋亡率的比較

表2 不同組別患者治療前MTB分離株感染

比較未轉陰組、轉陰組及對照組患者實際感染巨噬細胞的細菌數(shù)量、感染3 h和96 h菌落數(shù)量變化情況，結果表明，未轉陰組治療前初始感染菌量為7.01±0.37、感染3 h后菌量為5.75±0.30、感染96 h后菌量為6.75±0.34；轉陰組治療前初始感染菌量為7.11±0.36、感染3 h后菌量為5.81±0.24、感染96 h后菌量為6.98±0.17；對照組治療前初始感染菌量為6.97±0.03、感染3 h后菌量為5.46±0.05、感染96 h后菌量為6.75±0.18；Kruskal-Wallis檢驗結果顯示，抗結核治療2周未轉陰者、抗結核治療2周內(nèi)轉陰者及耐多藥結核病患者組間差異無統(tǒng)計學意義(K-W值=1.28，P=0.528)。

討 論

MTB是典型的胞內(nèi)致病菌，主要在巨噬細胞等宿主免疫系統(tǒng)細胞內(nèi)存活和繁殖。MTB感染人體后，主要被宿主巨噬細胞吞噬，未被機體免疫系統(tǒng)清除而潛伏下來的MTB也主要寄生于宿主巨噬細胞內(nèi)。MTB感染的后果及結核病的發(fā)生與否與宿主巨噬細胞密切相關。MTB感染后，可誘導宿主巨噬細胞產(chǎn)生不同的轉歸——凋亡或壞死[3]。凋亡可使巨噬細胞靜止地將抗原提呈給T細胞，誘導細胞免疫應答，消除MTB賴以生存的環(huán)境，阻止其傳播；而壞死可使宿主巨噬細胞膜破裂，使宿于其中的MTB被釋放出來，重新感染周圍宿主巨噬細胞，造成感染的播散。由此可見，宿主細胞的轉歸對MTB感染的控制極其關鍵。研究表明，不同毒力的MTB感染巨噬細胞后可誘導巨噬細胞產(chǎn)生不同的轉歸：高毒力MTB株H37Rv能夠抑制細胞凋亡，在胞內(nèi)存活、繁殖、擴散，導致細胞壞死，進而引發(fā)炎癥反應、細菌擴散；而H37Ra、卡介苗(BCG)等減毒株則能誘導巨噬細胞產(chǎn)生大量凋亡[4]。

不同于利用小鼠模型進行的MTB毒力檢測實驗[5]，結果表明，對于入組的5例初治涂陽肺結核患者，相比抗結核治療前，抗結核治療1周或2周后分離的結核分枝桿菌誘導巨噬細胞早期凋亡水平均有不同程度的上升，但不同患者結果間表現(xiàn)出異質(zhì)性。MTB感染巨噬細胞3 h后，5例中有4例患者抗結核治療1周及2周后巨噬細胞凋亡水平較治療前均有不同程度上升。未轉陰組患者，在抗結核治療1周或2周后分離的MTB較治療前誘導巨噬細胞凋亡水平均有上升，但差異無統(tǒng)計學意義。究其原因，可能由于本研究納入患者數(shù)量及MTB臨床分離株較少，有必要增加樣本量做進一步研究。此外，由于筆者僅收集了抗結核藥物治療1周或2周后的MTB，若繼續(xù)收集抗結核藥物治療后更長時間的菌株，可能會發(fā)現(xiàn)其誘導巨噬細胞早期凋亡水平的明顯變化，即隨著抗結核藥物治療的延續(xù)，細菌的毒力會呈現(xiàn)明顯下降，這對結核病患者的臨床治療及結核病傳染源的管理具有重要提示意義。

此外，筆者針對初治涂陽結核病患者抗結核藥物治療2周后痰涂片未轉陰患者、轉陰患者及耐多藥結核病患者化療前收集的MTB誘導巨噬細胞凋亡水平進行了分析。結果表明，未轉陰患者、轉陰患者及耐多藥患者的MTB臨床分離株感染巨噬細胞3 h后，其誘導巨噬細胞的早期凋亡的水平差異無統(tǒng)計學意義。而感染巨噬細胞96 h后，三組菌株誘導巨噬細胞早期凋亡水平差異有統(tǒng)計學意義，耐多藥組菌株誘導巨噬細胞早期凋亡水平高于未轉陰組和轉陰組，而轉陰組與未轉陰組比較差異無統(tǒng)計學意義。

本研究首次利用體外細胞水平的實驗初步探討了抗結核藥物治療后不同時間點MTB毒力的變化，發(fā)現(xiàn)隨著抗結核藥物治療的進行，細菌毒力未見明顯變化。究其原因，可能由于納入患者例數(shù)較少，同時，若延長抗結核藥物治療后收集各時間點的MTB臨床分離株，可能會出現(xiàn)細菌毒力的明顯改變。由此也提示，在臨床上，肺結核患者或許需要更長時間的住院或隔離治療才能有效地避免細菌在人群中的傳播。很多研究報道MTB成分能有效抑制或促進巨噬細胞凋亡[6-9]，也有關于細菌毒力變化的相關分子水平研究[10-12]。本研究并未涉及誘導細胞凋亡的具體成分或機制，這也需要進一步地進行分子或基因水平研究，通過干預和調(diào)控宿主巨噬細胞的凋亡進程，為結核病的預防、控制和根除提供新的靶點，同時也為結核病臨床治療策略或結核病傳染源管理提供理論依據(jù)。

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(本文編輯：李敬文)

Analysis ofMycobacteriumtuberculosisvirulence before and after anti-tuberculosis treatment for smear positive pulmonary tuberculosis patients

LILi,MAJi-lei,RENYi,XIEHong,TIANDan,NANJing,YUQi,TIANMao-peng,JINGYu-kai,FANXiong-lin,WANGWei-hua.

WuhanInstituteforTuberculosisControl,WuhanPulmonaryHospital,Wuhan430030,China

s:WANGWei-hua,Email:drwang65@163.com;FANXiong-lin,Email:xlfan@hust.edu.cn

Objective Evaluation of virulence ofMycobacteriumtuberculosis(MTB) isolated before and after treatment for newly diagnosed smear positive pulmonary tuberculosis (TB) patients. Methods Patients were recruited from Project of Free Quarantined Hospital Treatment for Newly Diagnosed Smear Positive Pulmonary TB Patients in Wuhan during 2014-2015. Fifteen strains of MTB isolated from patients before the initiation of anti-TB treatment, after one week or two weeks of anti-TB treatment from smear positive pulmonary TB patients who are still sputum smear positive after 2 weeks of anti-TB treatment, four MTB strains from pulmonary TB patients who are sputum smear negative during 2 weeks of anti-TB treatment and one multidrug-resistant MTB strain before the initiation of anti-TB treatment. Macrophages were infected with the different MTB strains cultured from different time points of sputum isolated from the different types of patients mentioned above in vitro for 3 hours or 96 hours. Flow cytometry was conducted to detect the early apoptotic level of macrophages. At the same time, the number of MTB colonies was counted. Results The percentage of early apoptosis of macrophages infected with cultured MTB from sputum isolated before, after one week or two weeks of anti-TB treatment from smear positive pulmonary TB patients who were still sputum smear positive after 2 weeks of anti-TB treatment were (2.95±1.13) %,(4.21±1.92) % and (3.73±1.36) % repectively, after infection for 3 h，displaying no significant difference (F=3.38,P=0.086); (4.25±0.48) %, (5.69±2.03) %, (5.06±1.25) % after infection for 96 h, displaying no significant difference (F=1.69，P=0.245). The percentage of early apoptosis of macrophages infected with cultured MTB from sputum isolated before treatment from smear positive pulmonary TB patients who were still sputum smear positive after treatment were (2.95±1.13) %,(4.05±1.87) % for who were negative after treatment and (4.38±0.29) % for MDR MTB after infection for 3 h, displaying no significant difference (F=1.94，P=0.380). The percentage were (4.25±0.48) %, (4.11±0.26) % and (5.39±0.24) % after infection for 96 h respectively, displaying no significant difference (F=11.97,P=0.003). No significant difference was observed as to the count of MTB colonies. Conclusion The virulence of MTB isolated is not significantly changed from MTB patients who are still sputum smear positive after 2 weeks of anti-TB treatment.

Tuberculosis, pulmonary;Mycobacteriumtuberculosis; Virulence; Evaluation studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.11.016

武漢市初治涂陽肺結核免費隔離治療項目(2012年7月)；武漢市中青年醫(yī)學骨干人才培養(yǎng)工程(武衛(wèi)生計生通〔2015〕9號)；武漢市黃鶴英才(醫(yī)療衛(wèi)生)計劃(武人才辦〔2016〕1號)

430030 武漢市結核病防治所 武漢市肺科醫(yī)院(李麗、任易、謝紅、田丹、南晶、王衛(wèi)華)；華中科技大學同濟醫(yī)學院病原生物學教研室(馬記磊、俞琦、田茂鵬、景玉凱、范雄林)

王衛(wèi)華，Email：drwang65@163.com；范雄林，Email：xlfan@hust.edu.cn

2016-07-01)

注：李麗、馬記磊對本文有同等貢獻，為并列第一作者