補(bǔ)腎法中藥對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松骨代謝指標(biāo)的影響

劉 爽 張玉蓮 畢聰聰 孫偉明

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300150)

補(bǔ)腎法中藥對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松骨代謝指標(biāo)的影響

劉 爽 張玉蓮 畢聰聰1孫偉明1

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300150)

目的 探討補(bǔ)腎法中藥對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松(OP)骨密度(BMD)、骨生物力學(xué)、血清堿性磷酸酶(ALP)、血清Ⅰ型前膠原羧端肽原(PICP)的影響。方法 將36只SD雌性大鼠隨機(jī)分為治療組、假手術(shù)組和模型組。切除雙側(cè)卵巢造模，治療組給予補(bǔ)腎法中藥治療，模型組予等量生理鹽水，灌胃3個(gè)月后取材。Medical viva CT40測(cè)量獲得BMD；三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)獲得最大應(yīng)變和彈性模量；酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒檢測(cè)血清ALP、PICP的含量。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組BMD水平明顯降低(P<0.05)，最大應(yīng)變和彈性模量均明顯下降，血清ALP水平明顯升高，血清PICP水平明顯降低(均P<0.05)。與模型組比較，治療組BMD無(wú)明顯差異，但均有增長(zhǎng)的趨勢(shì)，最大應(yīng)變和彈性模量均明顯升高，血清ALP水平明顯降低，PICP水平明顯升高(均P<0.05)。結(jié)論 補(bǔ)腎法中藥可能通過(guò)降低OP模型大鼠血清ALP含量，升高PICP含量，提高骨生物力學(xué)性能和BMD，達(dá)到治療OP的作用。

補(bǔ)腎法中藥；骨質(zhì)疏松；骨密度；骨代謝；堿性磷酸酶；I型前膠原羧端肽原

骨質(zhì)疏松(OP)具有高發(fā)病率、高骨折率、高致殘率、高致死率的特點(diǎn)〔1〕。中醫(yī)認(rèn)為，骨的生長(zhǎng)發(fā)育和強(qiáng)壯衰弱與腎密切相關(guān)，治療多從補(bǔ)腎出發(fā)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)骨密度(BMD)、骨生物力學(xué)和相關(guān)蛋白，探討補(bǔ)腎法中藥對(duì)OP模型大鼠骨代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)選用SD 雌性大鼠36只，體重(240±10)g，均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供〔許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004〕，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房。隨機(jī)分為治療組、模型組、假手術(shù)組各12 只。

1.2 藥物和試劑 補(bǔ)腎法中藥成分：淫羊藿10 g、補(bǔ)骨脂5 g、制首烏5 g、女貞子10 g。參照徐叔云《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中 “人和動(dòng)物按體表面積折算的等效劑量比值表”進(jìn)行給藥劑量計(jì)算。其中人(70 kg)與 SD 大鼠(200 g)之間系數(shù)為 0.018。由天津中醫(yī)藥大學(xué)制劑中心制備的生藥濃度為0.3 g/ml，200 g SD大鼠每日生藥2.7 g/kg；故 SD 大鼠每日需9 ml/kg 濃煎劑，約1 ml/100 g蒸餾水，10%水合氯醛 。

1.3 方法

1.3.1 OP模型制備 采用去除雙側(cè)卵巢的方法制備治療組和模型組OP大鼠。腹腔注射 10%水合氯醛(0.3 ml/100 g體重)麻醉，取仰臥位固定于無(wú)菌手術(shù)臺(tái)上，備皮，消毒，取腹側(cè)正中縱形切口，將組織鑷深入切口，提起腹腔脂肪，找到桑葚狀粉紅色卵巢，在子宮末端與卵巢之間的最細(xì)處用小號(hào)止血鉗夾閉，1號(hào)無(wú)菌絲線結(jié)扎，用眼科剪將卵巢全部切除，松開(kāi)止血鉗，確認(rèn)無(wú)出血后，將脂肪放入腹腔，同樣的方法切除右側(cè)卵巢。雙側(cè)卵巢切除后，縫合皮膚，消毒切口。肌注青霉素(40萬(wàn) U/ 只)7 d預(yù)防感染。假手術(shù)組大鼠僅切除部分卵巢周?chē)闹窘M織(大小約等同于卵巢重量)，其他處理同模型組。

1.3.2 給藥 治療組予補(bǔ)腎法中藥1 ml/100 g灌胃,模型組與假手術(shù)組予蒸餾水1 ml/100 g灌胃，持續(xù)12 w。

1.3.3 相關(guān)參數(shù)的檢測(cè) BMD：用Medical viva CT 40對(duì)左側(cè)脛骨近干骺端進(jìn)行顯微 CT掃描，測(cè)得BMD。生物力學(xué)：取大鼠左側(cè)股骨，將其放在MTS 858 Mini Bionix Ⅱ 型材料試驗(yàn)機(jī)上，支座跨距20 mm，在股骨中點(diǎn)加力，勻速加載，至標(biāo)本斷裂。采集數(shù)據(jù)并繪制載荷-變形曲線，測(cè)得最大撓度、彈性載荷、彈性撓度，計(jì)算出最大應(yīng)變和彈性模量。血清堿性磷酸酶(ALP)、I型前膠原羧端肽原(PICP)的檢測(cè)：在大鼠腹主動(dòng)脈中取血，離心，取上層血清-80℃保存?zhèn)溆?，采用酶?lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒測(cè)得血清ALP、PICP的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 補(bǔ)腎法中藥對(duì)OP大鼠BMD的影響 與假手術(shù)組BMD〔(569.58±76.40)mg/cm2〕相比，模型組〔(393.81±36.63)mg/cm2〕明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，治療組BMD〔(443.91±56.52)mg/cm2〕無(wú)明顯差異，但均有增長(zhǎng)的趨勢(shì)。

2.2 補(bǔ)腎法中藥對(duì)OP大鼠股骨生物力學(xué)的影響 與假手術(shù)組最大應(yīng)變(0.034±0.003)和彈性模量〔(6 912.90±967.68)mPa〕相比，模型組〔(0.026±0.003)，(4 828.92±577.07)mPa〕均明顯下降(P<0.05)。與模型組相比，治療組〔(0.031±0.004)，(5 812.50±534.28)mPa〕均明顯升高(P<0.05)。

2.3 補(bǔ)腎法中藥對(duì)OP大鼠ALP、PICP的影響 與假手術(shù)組ALP〔(22.96±3.14)μg/L〕、PICP〔(67.44±7.64)μg/L〕相比，模型組〔ALP(67.29±6.61)μg/L〕明顯升高，PICP〔(28.74±5.61)μg/L〕降低(P<0.05)；與模型組相比，治療組ALP〔(38.45±5.61)μg/L〕明顯降低，PICP〔(45.18±5.61)μg/L〕明顯升高(P<0.05)。

3 討 論

OP主要表現(xiàn)為腰腿部疼痛，嚴(yán)重者活動(dòng)受限，可參考中醫(yī)里的“骨痿”、“骨枯”和“骨痹”辨證論治。而中醫(yī)認(rèn)為骨病多由腎虛造成，腎為先天之本,主骨生髓，腎精虧虛，骨髓生化無(wú)源，骨骼失養(yǎng)，易與骨折；腎精足，骨髓生化有源，骨骼生長(zhǎng)發(fā)育強(qiáng)健〔2〕，故治則以補(bǔ)腎為主。中藥包括淫羊藿、補(bǔ)骨脂、制首烏、女貞子。其中補(bǔ)骨脂和淫羊藿補(bǔ)腎壯陽(yáng)，制首烏和女貞子補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨，四味藥陰中求陽(yáng)，陽(yáng)中求陰，共奏補(bǔ)腎壯骨之功。BMD是骨礦物密度的簡(jiǎn)稱(chēng)，表示骨質(zhì)量和骨強(qiáng)度的情況，反映OP程度，是一種可預(yù)測(cè)骨折危險(xiǎn)性的可靠指標(biāo)〔3〕。本研究去卵巢后大鼠OP模型建立成功，且結(jié)果說(shuō)明補(bǔ)腎法中藥可以增加骨質(zhì)量和骨強(qiáng)度，改善OP情況，降低骨折的風(fēng)險(xiǎn)。 骨組織是由有機(jī)物和無(wú)機(jī)鹽組成，當(dāng)兩者的含量維持在一定的范圍內(nèi)時(shí)，骨組織的吸收和合成相對(duì)平衡，骨量不丟失，骨組織保持良好的彈性和強(qiáng)度，骨的生物力學(xué)性能良好，能夠抵抗一定的外力〔4〕。當(dāng)骨量丟失，骨強(qiáng)度降低，骨抵抗變形下降，骨生物力學(xué)性能降低，骨脆性增加，易于骨折。在骨力學(xué)中，最大應(yīng)變是骨標(biāo)本在最大載荷作用下彎曲的長(zhǎng)度與其初始長(zhǎng)度的比值，表示骨標(biāo)本長(zhǎng)度的百分變化或相對(duì)變形，反映骨抵抗變形的能力〔5〕。彈性模量指骨對(duì)變形的阻力,反映骨內(nèi)在硬度,表示骨的一種抗應(yīng)變的能力〔6〕。本研究說(shuō)明補(bǔ)腎法中藥能提高骨對(duì)變形的阻力，改善骨的生物力學(xué)性能。 骨骼是在骨表面進(jìn)行骨吸收和骨形成的一個(gè)過(guò)程，主要由成骨細(xì)胞骨形成和破骨細(xì)胞骨吸收相互作用完成。當(dāng)骨吸收大于骨的形成，骨吸收量加快，骨丟失增多，形成OP〔6〕。血清中的ALP主要來(lái)自骨骼，由成骨細(xì)胞產(chǎn)生，參與骨轉(zhuǎn)換調(diào)解，是檢測(cè)骨吸收與骨形成的一種敏感的骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物〔7〕。本研究證明了補(bǔ)腎法中藥可以降低骨的高轉(zhuǎn)換率，抑制骨質(zhì)吸收，改善OP。血清PICP由成骨細(xì)胞合成，是骨組織中一種特有的膠原，其水平與骨形成的劑量呈正比，可反映成骨細(xì)胞的活性〔8〕。本研究結(jié)果說(shuō)明補(bǔ)腎法中藥可以提高成骨細(xì)胞的活性，使骨形成大于骨的吸收。

綜上，補(bǔ)腎法中藥能夠直接或間接增加骨質(zhì)量和骨強(qiáng)度，提高骨力學(xué)性能，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性，增加骨形成，抑制骨吸收，促進(jìn)骨的形成，降低骨折風(fēng)險(xiǎn)，最終達(dá)到治療OP的目的。

1 中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨科分會(huì).骨質(zhì)疏松骨折診療指南〔J〕.中華骨科雜志,2008；28(10):875-8.

2 孫廣仁.中醫(yī)基礎(chǔ)理論〔M〕.第2版.北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2007:122-3.

3 姚新苗,徐祿基,冷 濤,等.益骨口服液對(duì)去勢(shì)大鼠骨密度與骨生物力學(xué)的影響〔J〕.浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010;34(2):142-3.

4 朱慧鋒,王珠美,王維佳.中藥對(duì)去卵巢大鼠骨生物力學(xué)影響的研究進(jìn)展〔J〕.中醫(yī)正骨,2010;22(1):73-5.

5 謝江濤,羅 珊.有氧運(yùn)動(dòng)配合雷洛昔芬對(duì)骨生物力學(xué)性能影響的研究〔J〕.四川體育科學(xué),2014;33(4):40-2.

6 孫曉暉,陳文雙,陳春玲,等.長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素對(duì)大鼠的骨生物力學(xué)影響〔J〕.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志,2015;21(4):418-20.

7 白孟海,白 潔,鄭 蓉,等.阿侖膦酸鈉對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者骨密度及血清堿性磷酸酶、骨鈣素的影響〔J〕.西北國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志,2012;33(3):248-50.

8 陳樹(shù)清,周厚明,孫保國(guó),等.補(bǔ)腎方對(duì)去卵巢大鼠血清中PICP、ICTP的影響〔J〕.中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志,2009;17(3):13-4.

〔2016-05-27修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

Effect of bushen traditional Chinese medicine for bone metabolism indexes in ovariectomized rat models of osteoporosis

LIU Shuang, ZHANG Yu-Lian, BI Cong-Cong,etal.

The Second Afilliated Hospital of Tianjin University of TCM, Tianjin 300150, China

Objective To observe effect of bushen traditional Chinese medicine on bone mineral density, bone biomechanics, alkaline phosphatase, PICP, estradiol related indicators in ovariectomized rat model of osteoporosis.Methods 36 SD female rats are randomly divided into therapy,model and control groups. Cutting off ovaris on both sides made rat model of osteoporosis. After the success of the molding, therapy group was given corresponding medicine,drawing materials after 3months. Micro CT measurement was used to obtain data on bone mineral density；three-point bending test was used to obtain data on bone biomechanics;ELISA kit was used to measure the contents of ALP, PICP and E2.Results Compared with those of control group, the content of BMD was markedly reduced(P<0.05), maximum strain and modulus of elasticity of model group were markedly reduced(P<0.05), the content of ALP was markedly increased(P<0.05), the contents of PICP and E2 were markedly reduced. Compared with those of model group, the content of BMD in therapy group had no obvious difference, but had the growth tendency; maximum strain and modulus of elasticity of model group were markedly increased(P<0.05); the content of ALP was markedly reduced(P<0.05);the contents of PICP and E2 were markedly increased(P<0.05).Conclusions Bushen traditional Chinese Medicine might achieve the treatment effect of the osteoporosis by lowering ALP and increasing PICP and E2 levels ,improving bone mineral density and bone biomechanical properties changes in ovariectomized rat model of osteoporosis.

Bushen traditional Chinese medicine；Osteoporosis； Bone metabolism；BMD； ALP； PICP

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81202652)；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計(jì)劃(No.13JCQNJC11700)

張玉蓮(1963-)，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療老年病、腦病的臨床、科研及教學(xué)研究。

劉 爽(1984-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療老年病、腦病的臨床、科研及教學(xué)研究。

R25

A

1005-9202(2017)03-0529-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.003

1 天津中醫(yī)藥大學(xué)