瑞舒伐他汀對(duì)擴(kuò)張型心肌病大鼠心肌組織賴(lài)氨酰氧化酶表達(dá)水平的影響

劉會(huì) 楊龍△ 榮季冬 蔣智 王紀(jì)人

(1.貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng) 550002； 2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，貴州 遵義 563003)

·論 著·

瑞舒伐他汀對(duì)擴(kuò)張型心肌病大鼠心肌組織賴(lài)氨酰氧化酶表達(dá)水平的影響

劉會(huì)1楊龍1△榮季冬2蔣智1王紀(jì)人1

(1.貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng) 550002； 2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，貴州 遵義 563003)

目的 探討瑞舒伐他汀對(duì)擴(kuò)張型心肌病大鼠心肌組織賴(lài)氨酰氧化酶(LOX)表達(dá)的影響。方法 成年大鼠50只，隨機(jī)分為三組：對(duì)照組(NS組：n=10只，腹腔注射等量生理鹽水)；擴(kuò)張型心肌病模型組(DCM組：n=20，腹腔注射阿霉素)；干預(yù)組(GY組：n=20，腹腔注射阿霉素，同時(shí)給予瑞舒伐他汀灌胃)。10周末處死大鼠，HE、Masson染色測(cè)定心肌組織膠原纖維化情況；提取左室心肌組織RNA及蛋白質(zhì)，RT-PCR法及Western blot測(cè)定心肌組織LOX的mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 HE、Masson染色顯示DCM組大鼠心肌組織明顯纖維化，而GY組大鼠心肌組織纖維化程度較輕；DCM組大鼠心肌組織LOX的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于NS組(P<0.01)；與DCM組相比， GY組心肌組織LOX的mRNA及蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)。結(jié)論 瑞舒伐他汀可逆轉(zhuǎn)DCM大鼠心肌組織纖維化及LOX的表達(dá)。

擴(kuò)張型心肌病； 蛋白賴(lài)氨酰氧化酶； 瑞舒伐他汀

擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)是一種病因未明的心肌疾病，好發(fā)于青壯年，預(yù)后極差，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量；其主要病理特征是心肌細(xì)胞變性、壞死，心肌間質(zhì)中膠原纖維大量增生、排列紊亂，導(dǎo)致心肌組織重塑及心功能不全。賴(lài)氨酰氧化酶(lysyl axidase,LOX)在膠原纖維和彈性纖維的活化和表達(dá)中具有重要的作用，參與很多心血管疾病的發(fā)生發(fā)生發(fā)展[1]。在心肌梗死后心室重塑過(guò)程中，心肌纖維化程度越重，LOX表達(dá)水平越高。目前的研究多涉及LOX在心肌組織重塑中的表達(dá)變化情況，而關(guān)于藥物干預(yù)后LOX表達(dá)變化國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)旨在觀測(cè)瑞舒伐他汀對(duì)DCM大鼠心肌組織膠原纖維及LOX表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組

8周齡、SPF級(jí)雄性SD大鼠50只[合格證號(hào)：SCXK(渝)2012-0005]置于室溫22～25 ℃、相對(duì)濕度45%左右的動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)，顆粒飼料[合格證號(hào)：SCXK-(粵)2008-0002]喂養(yǎng)，均自由飲水。隨機(jī)分為三組：對(duì)照組(NS組：n=10)，腹腔注射等量生理鹽水；擴(kuò)張型心肌病模型組(DCM組：n=20)，腹腔注射阿霉素，每次2.5 mg/kg，1次/周，共6周，累計(jì)劑量15 mg/kg；干預(yù)組(GY組：n=20)，腹腔注射阿霉素，每次2.5 mg/kg，1次/周，共6周，累計(jì)劑量15 mg/kg，同時(shí)給予瑞舒伐他汀3 mg/kg·d-1灌胃。

1.2 心臟超聲檢測(cè)

10周末，10%水合氯醛(4 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，8% Na2S脫去大鼠胸部皮毛。采用VisualSonics Vevo770超聲心動(dòng)圖儀17.5 MHz探頭(加拿大Visual Sonics公司)測(cè)量左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)、左室收縮未期內(nèi)徑(LVESd)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS)。

1.3 組織標(biāo)本處理及HE、Masson染色

大鼠麻醉狀態(tài)下開(kāi)胸取出心臟，去掉殘余的大血管及心外膜，去除右心室和右心房，保留室間隔，冷肝素鹽水洗凈心腔內(nèi)殘余的血液。垂直心臟左心室長(zhǎng)軸將心臟一分為二，心底部?jī)龃嬗谝旱袡z測(cè)RNA和蛋白質(zhì)，心尖部用于HE染色。常規(guī)石蠟包埋后制成5 μm厚的切片，行HE、Masson染色。采用Nikon Eclipse 80i 顯微鏡對(duì)所得切片進(jìn)行觀察并采集圖像。

1.4 RT-PCR法檢測(cè)

提取凍存心肌組織總RNA，計(jì)算總RNA的濃度和純度。取1 μg總RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)方法合成cDNA，產(chǎn)物按PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行PCR反應(yīng)。所有引物均參造Genebank提供的序列，由大連晨鈺生物有限公司合成。β肌動(dòng)蛋白(β-actin)上游引物：5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，下游引物：5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，擴(kuò)增片段為150bp；LOX上游引物:5’-ATGCCAGCACACAGAGGAGAG-3’，下游引物：5’-AGGCGTGATGTCCTGTGTAGC-3’，擴(kuò)增片段為300 bp，反應(yīng)體系為25 μL， 95℃變性25 s，52℃ 退火35 s，72 ℃ 延伸65 s，共循環(huán)42次。PCR產(chǎn)物以3%瓊脂糖凝膠電泳，以Bio-Image Analysis System分析各條帶的光密度值，計(jì)算目的條帶與內(nèi)參(β-actin)的比值，以此作為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 Western Blot法檢測(cè)

提取大鼠心肌組織全蛋白，測(cè)定蛋白濃度。取50 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白及轉(zhuǎn)膜，15%脫脂牛奶-PBST溶液室溫下封閉60 min，然后將膜與一級(jí)抗體(β-actin∶鼠抗單克隆抗體，1∶2 000；LOX∶羊抗人多克隆抗體，1∶500；)在4 ℃結(jié)合過(guò)夜，次日PBST洗膜10 min×5次，加入HRP標(biāo)記的二級(jí)抗體(β-actin∶山羊抗小鼠，1∶20 000；LOX∶兔抗羊，1∶2 000；)室溫下結(jié)合60 min，PBST洗膜10 min×5次，ECL法發(fā)光顯像，X線壓片曝光，將膠片進(jìn)行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析，用目標(biāo)蛋白的灰度值比β-actin的灰度值，所得數(shù)值代表目標(biāo)蛋白的相對(duì)含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 心衰癥狀

經(jīng)腹腔注射阿霉素后，DCM組及GY組大鼠逐漸出現(xiàn)心衰癥狀，活動(dòng)量減少，進(jìn)食量下降，并出現(xiàn)不同程度脫毛、紫紺及水腫。

2.2 各組大鼠超聲心動(dòng)圖比較

與NS組比較，DCM組、GY組大鼠心臟普遍擴(kuò)大，心臟室壁運(yùn)動(dòng)減弱，左心室收縮及舒張功能明顯下降，表現(xiàn)為L(zhǎng)VEDd和LVESd明顯增加，LVEF及%FS明顯下降；與DCM組比較，GY組LVEDd和LVESd有所下降，LVEF及%FS有所回升(P<0.05)。見(jiàn)表 1。

表1 各組大鼠心臟超聲參數(shù)變化±s)

注：與NS組比較，aP<0.05，bP<0.05。

2.3 HE染色

與NS組比較，DCM組和GY組大鼠心肌細(xì)胞水腫，排列紊亂，細(xì)胞間隙增寬，可見(jiàn)心肌纖維斷裂；與DCM組相比，GY組心肌損害有所減輕。見(jiàn)圖1。

注：a.NS；b.DCM；c.GY圖1 各組大鼠心肌組織HE染色

2.4 Masson染色

與NS組比較，DCM組和GY組大鼠心肌組織均有明顯纖維化，而GY組心肌組織纖維化有所減輕。見(jiàn)圖2。

注：a.NS；b.DCM；c.GY圖2 各組大鼠心肌組織Masson染色

2.5 各組大鼠心肌組織LOX mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較

與NS組比較，DCM組大鼠心肌組織LOX mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)；與DCM組比較，GY組大鼠心肌組織LOX mRNA和蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)。見(jiàn)圖3、表2。

M.Maker；1：NS；2：DCM；3：GY 1：NS；2：DCM；3：GY 圖3 各組大鼠心肌組織LOX mRNA和蛋白表達(dá)的比較

組別鼠(n)LOX(mRNA)LOX蛋白NS組100．54±0．030．56±0．03DCM組200．85±0．02a0．80±0．04aGY組200．66±0．02b0．67±0．02b

注：與NS組比較，aP<0.01；與DCM組比較，bP<0.01。

3 討 論

DCM是一種以全心擴(kuò)大伴收縮功能障礙為典型特征的心肌病，病程呈進(jìn)行性惡化，預(yù)后較差，病理特征是心肌細(xì)胞變性、壞死及心肌間質(zhì)中膠原纖維大量增生。心肌組織重塑的過(guò)程貫穿DCM發(fā)病的始終。

LOX是膠原纖維和彈性纖維通過(guò)共價(jià)交聯(lián)取得穩(wěn)定性和發(fā)育成熟的關(guān)鍵酶，具有穩(wěn)定細(xì)胞外基質(zhì)免受MMP降解的功能[2]。LOX表達(dá)過(guò)少，組織力學(xué)性能不足；但LOX表達(dá)過(guò)多，易致組織膠原沉積及纖維化[3]。過(guò)度的膠原沉積可引起心肌纖維化，降低心臟舒張功能，最終導(dǎo)致心力衰竭。此外，有研究[4]表明，心肌組織LOX表達(dá)上調(diào)與慢性心力衰竭左室順應(yīng)性降低有關(guān)，LOX過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)膠原纖維增生，使心肌順應(yīng)性降低，這可能是引起慢性心力衰竭者心臟重塑的一個(gè)重要原因。此外，提取心肌梗死患者死亡后的心臟組織發(fā)現(xiàn)， LOX表達(dá)明顯上調(diào)，且與細(xì)胞外基質(zhì)成分改變及心肌纖維化形成有關(guān)[5]。既往我們的研究表明，慢性心力衰竭小鼠心肌組織LOX表達(dá)上調(diào)，阿托伐他汀可下調(diào)慢性心力衰竭小鼠心肌組織LOX，LOX可通過(guò)p38及NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)MMP-9的表達(dá)[6]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組大鼠心功能正常；DCM組大鼠心功能惡化，心肌組織膠原纖維、LOX mRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)；應(yīng)用瑞舒伐他汀干預(yù)DCM大鼠后，心肌組織膠原纖維、LOX mRNA和蛋白表達(dá)下降。實(shí)驗(yàn)提示瑞舒伐他汀可逆轉(zhuǎn)DCM大鼠心肌組織膠原纖維及LOX的表達(dá)，這可能是瑞舒伐他汀抑制心臟重塑的重要機(jī)制。LOX可能是調(diào)節(jié)心肌組織膠原纖維變化的重要的細(xì)胞因子。瑞舒伐他汀可否通過(guò)別的細(xì)胞因子影響膠原纖維的表達(dá)，本研究未涉及。

[1] Li W，Liu G, Chou IN, et a1. Hydrogen peroxide-mediated, lysyl oxidase-dependent chemotaxis of vascular smooth muscle cells[J]. J Cell Biol, 2000, 78(4): 550-557.

[2] Csiszar K. Lysyl Oxidase: a novel multifunctional amine oxidase family [J].Prog Nuclei Acid Res Mol Bio, 2001, 70: 1-32.

[3] Smith-Murgo Li, Kagan HM. Lysyl Oxidase: properties, regulation and multiple functions in biology [J]. Matrix Biol, 1998, 16(7): 387-398.

[4] Lopez B, Querejeta R, Gonzalez A, et al. Impact of treatment on myocardial lysyl oxidase expression and collagen cross-linking in patients with heart failure [J]. Hypertension， 2009, 53(2): 236-242.

[5] Xie Y, Chen J, Han P, et al. Immunohistochemical detection of differentially localized up-regulation of lysyl oxidese and down-regulation of matrix metallopreinase-1 in rhesus monkey model of chronic myocardial infarction [J]. Exp Biol Med， 2012, 237(7): 853-859.

[6] 劉會(huì), 榮季冬, 張曙影, 等．阿托伐他汀對(duì)慢性心力衰竭小鼠心肌組織賴(lài)氨酰氧化酶表達(dá)的影響[J]．中華老年心腦血管病雜志, 2013, 15(6): 628-631．

Effects of rosuvastatin on expression of lysyl oxidase in rat heart with dilated cardiomyopathy

LiuHui1,YangLong1,RongJidong2,JiangZhi,WangJiren.

1.DepartmentofCardiology,GuizhouProvincialPeople'sHospital,Guiyang550002,Guizhou,China. 2.DepartmentofCardiology,theAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege, 563003,Guizhou,China.

Objective To explore the effects of rosurvastatin on expression of lysyl oxidase (LOX) in myocardial tissue of rats with dilated cardiomyopathy (DCM).Methods Fifty SD rats were randomly divided into 3 groups which were control group (n=10, equivalent normal saline was intraperitoneal injected), DCM group (n=20, 2.5 mg·kg-1adriamycin was intraperitoneal injected every time, one time every week for 6weeks), and treatment group (n=20, 2.5mg·kg-1adriamycin was intraperitoneal injected every time, one time every week for 6weeks, gastric lavage in rosurvastain 3 mg·kg-1·d-1at the same time). At the end of week 10, mice were sacrificed, HE and Masson pathological staining, analysis of degree fibering in the myocardial tissue, expression level of LOX mRNA and protein in myocardial tissue of DCM rats were measured by RT-PCR and western blot (WB).Results HE and Masson pathological staining was shown myocardial tissue significantly fibering in DCM group than that in control group, and significantly decreased in treatment group. The expression level of LOX mRNAs and protein were significantly increased in DCM group than that in control group (P<0.01), and were significantly decreased in treatment group than that in DCM group (P<0.01).Conclusion rosurvastatin can attenuate the increased-expression of LOX and fibering in myocardial tissue of DCM rat.

Dilated cardiomyopathy； Protein-lysine 6-oxidese； Rosurvastatin

R-332

A

1000-744X(2016)08-0787-03

2016-03-06)

△通信作者，E-mail：yanglong1001@163.com