五味子不同產(chǎn)地、部位及提取工藝對木脂素成分含量影響的研究

肖瑞穎，王 偉，錢俊峰

(天津中新藥業(yè)集團股份有限公司樂仁堂制藥廠，天津 300112)

五味子不同產(chǎn)地、部位及提取工藝對木脂素成分含量影響的研究

肖瑞穎，王 偉*，錢俊峰

(天津中新藥業(yè)集團股份有限公司樂仁堂制藥廠，天津 300112)

目的：探究五味子藥材不同產(chǎn)地、不同部位及不同提取方式對木脂素成分含量的影響，為本廠含有五味子的品種選擇適宜的藥材產(chǎn)地及工藝提供科學的理論依據(jù)。方法：采用高效液相色譜法(HPLC)測定不同產(chǎn)地、不同部位五味子中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的含量；同時，分別考查不同提取工藝(水煮、不同乙醇體積分數(shù)熱回流、滲漉)對木脂素類含量的影響，使用正交試驗方法進一步優(yōu)化確定五味子滲漉工藝對四種木脂素類成分的最佳提取條件。結(jié)果：不同產(chǎn)地五味子木脂素成分都主要集中在種仁中，果皮中的含量較少；以乙醇熱回流及滲漉提取工藝對木脂素成分的含量提取效果好，正交試驗中以乙醇體積分數(shù)的影響最為顯著，其次是提取倍數(shù)。結(jié)論：五味子中有效成分主要存在于種仁中，在大生產(chǎn)工藝中，需將五味子破碎，有利于有效成分的煎出；在提取工藝中，提示在工業(yè)化生產(chǎn)過程中，盡量選取體積分數(shù)較大的乙醇，以便提取完全。

五味子，木脂素，提取法，正交試驗

五味子具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功效[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]，列為上品?，F(xiàn)代藥理研究證明五味子具有增強心血管功能[3，4]、降血糖[5]、保肝[6]、抗氧化抗疲勞，延緩衰老[7，8]、鎮(zhèn)靜催眠[9]、保護腦神經(jīng)細胞[10]、抗腫瘤[11]等作用，而木脂素成分是五味子的主要活性成分。本廠目前有多個品種處方中含有五味子藥材，其提取方式及檢測指標各異。故本試驗擬對五味子不同產(chǎn)地、不同部位、不同提取方式進行木脂素含量測定，分析五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素在不同部位中的分布規(guī)律，根據(jù)成藥的功效需求選擇適宜的藥材產(chǎn)地及提取工藝，以期可為本廠現(xiàn)有品種的工藝優(yōu)化提供依據(jù)，對今后大品種開發(fā)及新品研發(fā)中的工藝選擇也具有指導意義。

1 儀器與試藥

Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters)；超聲清洗器SK8200LH(天津星亞玻璃儀器銷售公司)；sartorius CP225D(十萬分之一天平)；sartorius CP224S (萬分之一天平)；電熱鼓風干燥箱DGG-101-1(天津天宇)；調(diào)溫電熱套ZDHW(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA(上海亞榮)；高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。北五味子(批號1507336，1509231)、南五味子(批號1509232)藥材均購自天津中藥飲片廠，均符合2015年版《中國藥典》規(guī)定。五味子醇甲(批號110857-200405)、五味子酯甲(批號111529-200604)、五味子甲素(批號110764-201111)、五味子乙素(批號110765-200407)均為含量測定用，購自中國藥品生物制品檢定所。甲醇(天津市康科德科技有限公司)為色譜純；乙腈(EMD Millipore Corporation)為色譜純；甲醇(EMD Millipore Corporation)為色譜純；95%乙醇(天津市康科德科技有限公司)；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Shim-pack C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，以甲醇流動相A，水為流動相B進行梯度洗脫(0～25 min，62%A；25～37min，62%A～80%A，37～50 min，80%A～90%A)，檢測波長：217 nm，流速：1.0 ml/min，柱溫：35 ℃，進樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素對照品適量，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得含五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素分別為69.20、36.2、40.8和48.2 μg/ml的混合對照品溶液，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取樣品粉末約0.25 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，超聲處理30 min，冷卻至室溫，加甲醇補足減少的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。分別精密吸取對照品和供試品溶液各10 μl注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定，色譜圖見圖1。

1. 五味子醇甲 2. 五味子酯甲 3. 五味子甲素 4. 五味子乙素

2.3 線性關系考查 精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液2、4、6、8、10和12 μl，按“2.1”項色譜條件進樣，測定，以峰面積為縱坐標(Y)，進樣量為橫坐標(X)繪制標準曲線，計算五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的回歸方程分別為Y=884 789X+881 473(r=0.999 3)、Y=367 322X+366 547(r=0.999 3)、Y=601 100X+561 909(r=0.998 2)和Y=676 157X+705 425(r=0.999 6)，結(jié)果表明五味子醇甲在138.4～830.4 μg、五味子酯甲在72.4～434.4 μg、五味子甲素在81.6～489.6 μg、五味子乙素在96.4～578.4 μg范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關系。

2.4 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液10 μl，按“2.1”項下色譜條件進樣6次，計算五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素峰面積的RSD分別為0.92%、0.82%、1.10%和0.90%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復性考查 精密稱取同批五味子樣品6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素質(zhì)量分數(shù)的RSD分別為1.8%、1.4%、2.0%和1.7%，表明該方法重復性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12和24 h進樣10 μl進行分析，測定峰面積值，計算五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素峰面積的RSD值分別為0.96%、0.86%、1.04%和0.98%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗 精密稱取已知指標成分含量的五味子藥材粉末9份，每份約0.125 g，分別精密加入高、中、低質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的平均加樣回收率分別為97.23%、97.67%、98.38%和96.14%，RSD依次為1.8%、1.4%、1.8%和1.6%。

2.8 樣品測定 精密稱取不同樣品0.25 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算各指標成分含量，結(jié)果見表1。

3 工藝路線的確定

3.1 水提取工藝 取批號為1507336的五味子100 g，用水煮兩次，第一次4倍量4 h，第二次2倍量2 h，合并水煮液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.18～1.20，烘干，稱重，備用。

3.2 乙醇熱回流工藝 取批號為1507336的五味子100 g，分別選用60%乙醇、80%乙醇和90%乙醇熱回流兩次，第一次4倍量4 h，第二次2倍量2 h，合并水煮液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.18～1.20，烘干，稱重，備用。

表1 不同產(chǎn)地、不同部位五味子4種木脂素成分的含量及占比

3.3 滲漉工藝正交試驗設計 參考企業(yè)品種含有五味子的工藝參數(shù)，取批號為1507336的五味子藥材，平均分成若干份，每份100 g，以五味子木脂素的轉(zhuǎn)移率及出膏率為考查指標，以乙醇體積分數(shù)、乙醇用量、滲漉速度為考查因素，對五味子滲漉工藝進行考查。試驗設計水平因素見表2。

表2 L9(34)正交試驗水平因素表

3.4 各提取方式對4種木脂素含量的影響 取各提取樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算各指標成分含量，結(jié)果見表3。

表3 不同提取方式對五味 子中4種木脂素含量的影響

3.5 滲漉工藝樣品含量測定及結(jié)果 取9份樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算各指標成分含量。對正交結(jié)果進行多指標綜合評分[12]。評分時以各指標最大值作為參照對數(shù)據(jù)進行歸一化，再給出不同權(quán)重，總木脂素轉(zhuǎn)移率與出膏率權(quán)重系數(shù)分別設為0.7和0.3。以綜合值進行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表4。綜合評分(M)=[(PA×Ai/A優(yōu))+(PB×Bi/B優(yōu))]×100，式中PA為轉(zhuǎn)移率權(quán)重系數(shù)，Ai為轉(zhuǎn)移率指標測定值，A優(yōu)為轉(zhuǎn)移率指標最大值；PB為出膏率權(quán)重系數(shù)，Bi為出膏率指標測定值，B優(yōu)為出膏率指標最大值。

表4 L9(34)正交試驗各指標測定值分析結(jié)果

3.6 正交試驗結(jié)果分析 正交試驗各指標測定結(jié)果及極差分析結(jié)果見表5。由直觀分析結(jié)果看出：各因素對結(jié)果的影響次序為A>B>C，最佳提取工藝為A2B3C3。但以極差最小的C因素為誤差項進行方差分析發(fā)現(xiàn)，因素對試驗結(jié)果均無顯著性差異，且綜合考慮大生產(chǎn)時成本問題及操作問題，確定最佳提取工藝為A2B2C3，即用80%乙醇，滲漉速度為6 ml/kg·min-1，收集7倍量滲漉液。

4 討論

4.1 五味子木脂素含量在方法學試驗中采用單因素方法，考查了不同提取方式(回流和超聲)、不同溶劑(50%甲醇、甲醇、60%乙醇和95%乙醇)、不同提取時間(10、20和30 min)對五味子木脂素的影響，結(jié)果顯示甲醇超聲提取30 min效果最好。

4.2 通過考查不同產(chǎn)地五味子，發(fā)現(xiàn)其木脂素成分都主要集中在種仁中，果皮中的含量較少；提示在大生產(chǎn)過程中，需將五味子破碎，將果仁充分暴露，這樣有利于有效成分被完全提取。

4.3 本文通過對五味子不同提取方式進行試驗，可以看出：水提取時出膏率高，但其總木脂素含量較低，因為五味子木脂素親脂性較強，在水中溶解度較低，盡管加熱木脂素類成分轉(zhuǎn)移率也較低；同時通過正交試驗方法對五味子滲漉工藝進行優(yōu)化篩選，發(fā)現(xiàn)乙醇體積分數(shù)越高，對五味子木脂素的提取率越高，提取倍數(shù)越多，出膏率也隨之增加，從效果及成本方面綜合考慮，建議選取80%乙醇，7倍量進行滲漉；而較高濃度乙醇熱回流方式與滲濾工藝效果相當，提取木脂素效果均較好，分析是因為親脂性較強的五味子木脂素在高濃度的乙醇中溶解度較大，說明五味子適合較高濃度乙醇提取。

1 中國藥典[S].一部.2015：66-67

2 張樹生譯. 神農(nóng)本草經(jīng)譯注[M].北京：中國人民大學出版社，2010:46

3 劉菊秀，陳靜，苗戎，等. 北五味子對心臟電活動及收縮力的影響[J].中草藥，1999,30(4):280-282

4 Chin P Y，Mak D H，Poon M K，etal.Role of cytochrome P-450 in schisandrin B- induced antioxidant and heat shock responses in mouse liver[J].Life Sci，2005,77 (23):2887- 2895

5 馬育軒，范越，張曉娟，等．五味子多糖干預胰島素抵抗大鼠作用研究[J].中醫(yī)藥信息，2014,31(2):7-8

6 Lam P Y，Chiu P Y，Leung H Y，etal．Schisandrin B cotreatment ameliorates the impairment on mitochondrial antioxidant status in various tissues of long-term ethanol treated rats[J].Fitotcrapia，2010,81(8):1239-1245

7 王文燕，陳建光.五味子的藥理作用及開發(fā)研究[J].華北大學學報·自然科學版， 2007,8(2):128-133

8 文惠玲，李曼莎，宋文瑤，等．五味子低溫水提取物HPLC特征圖譜的研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2009,20(3):244-246

9 高家榮，季文博，姜輝，等．酸棗仁-五味子藥對醇水雙提物對PCPA 致失眠大鼠氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的影響[J].中藥材，2013,36(10):1635-1639

10 姜恩平，王帥群，王卓，等．北五味子總木脂素對腦缺血模型大鼠神經(jīng)細胞凋亡及p- AKT表達的影響[J].中國中藥雜志，2014,39(9):1680- 1684

11 姜恩平，李賀，于春艷，等．五味子乙素通過 p38MAPK信號通路對結(jié)腸癌 SW480 細胞凋亡和侵襲的影響[J].吉林大學學報·醫(yī)學版，2015,41(4):675-679

12 徐連明，邵杰，付小環(huán)，等.正交試驗優(yōu)選全蝎鹽制工藝的研究[J].中草藥，2010,41(11)：1811-1812

2016-07-15

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1006-5687(2016)05-0008-04

*通訊作者：王偉，E-mail: lrtjs@126.com。