大鼠被動皮膚過敏試驗影響因素探討

王 沖，侯 娟，戚文軍，于 彤，芮 菁

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

實驗研究

大鼠被動皮膚過敏試驗影響因素探討

王 沖，侯 娟，戚文軍，于 彤，芮 菁

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

目的：系統(tǒng)性研究大鼠被動皮膚過敏試驗(PCA)的影響因素，為選擇敏感試驗條件和提高試驗預(yù)測的準確性提供依據(jù)。方法：采用卵白蛋白(OVA)為PCA試驗抗原，在不同條件下(OVA致敏劑量、添加佐劑、佐劑用量、致敏和被動致敏動物體質(zhì)量及致敏時間)進行PCA試驗。結(jié)果：①在不加弗氏完全佐劑(FCA)的條件下，在2.5～80 mg/只劑量范圍內(nèi)均未得到PCA陽性結(jié)果。②FCA顯著增加大鼠肌體免疫應(yīng)答的敏感性；加用FCA時，OVA用量宜選用5～20 mg/只。③以每只動物致敏1 ml計，0.4 ml FCA∶0.6 ml溶媒、0.5 ml FCA∶0.5 ml溶媒及0.6 ml FCA∶0.4 ml溶媒三種配比方式均可用于PCA試驗。④推薦最佳實驗動物體質(zhì)量為200～300 g。⑤致敏后12～14 d，PCA藍斑直徑可達峰值，最短致敏周期為8 d。結(jié)論：OVA致敏劑量、添加佐劑、佐劑用量、致敏和被動致敏動物體質(zhì)量及致敏時間因素均對PCA結(jié)果有影響，試驗時應(yīng)予以重視。

被動皮膚過敏試驗，OVA，F(xiàn)CA

被動皮膚過敏試驗(passive cutaneous anaphylaxis，PCA)，是一種利用與同種或異種動物組織有結(jié)合性的抗體所引起的局部過敏反應(yīng)，檢測抗體或抗原的高敏感度方法。該方法為國家食品藥品監(jiān)督管理局《藥物非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》(下文簡稱《指導(dǎo)原則》)所推薦[1]，結(jié)合全身主動過敏試驗(ASA)，共同評價藥物免疫原性或抗Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)作用[2]。PCA的試驗方法在《指導(dǎo)原則》中雖有規(guī)定，但均為原則性描述，缺乏具體操作的指導(dǎo)性作用。國內(nèi)雖已有學(xué)者對試驗動物品系[3]、注射途徑[4]及假陰性試驗結(jié)果[5]等影響因素做了有益的探討，但仍存在一些影響因素尚未見報道，值得進一步研究。本試驗繼續(xù)對PCA試驗的影響因素進行探索，以期甄選出敏感的實驗條件，提高試驗穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 動物 大鼠(SD)，SPF級，雄性。動物來源：北京維通利華實驗動物公司，生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2012- 0001。大、小鼠維持飼料來源：北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，許可證號SCXK(京)2009-0012。飼養(yǎng)條件：動物飼養(yǎng)室溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%，實驗動物使用許可證號SYXK(津)2011-0007。人工照明，12 h明/12 h暗。實驗動物于環(huán)境中適應(yīng)至少3 d后用于實驗。

1.2 藥品 卵白蛋白(OVA，Sigma公司，批號SLBK1399V)；弗氏完全佐劑(FCA，Sigma公司，批號SLBJ2846V)；氯化鈉注射液(NS，中國大冢制藥有限公司，批號3J79D1)；烏拉坦(天津市華東試劑廠，生產(chǎn)日期2013年5月6日)；伊文思藍(北京化學(xué)試劑公司，批號130535)。

1.3 設(shè)備 XS-205及XP2001S型電子天平(梅特勒公司)；數(shù)顯游標卡尺(美國CT公司生產(chǎn))；VELOCITY 18R型離心機(Dynamica公司)。

1.4 方法

1.4.1 OVA致敏劑量對PCA試驗的影響 致敏：取雄性SPF級SD大鼠18只，體質(zhì)量180～220 g，隨機分為6組，每組3只。各組大鼠分別經(jīng)腹腔注射給予卵白蛋白溶液2.5、5、10、20、40及80 mg/只致敏，每次注射體積為1 ml/只，隔日1次，共3次。首次致敏后第16 d，將動物以25%烏拉坦麻醉后，經(jīng)腹主動脈取血，靜置凝固20 min以上，2 500 r/min離心10 min，分離抗血清原液，將每組動物的抗血清混合，-4 ℃保存?zhèn)溆?。被動致敏：另取雄性SPF級SD大鼠36只，體質(zhì)量180～220 g，隨機分為6組，對應(yīng)致敏試驗中2.5、5、10、20、40及80 mg/只劑量組，每組6只動物。被動致敏的前1 d，將各組動物背部脊柱兩側(cè)常規(guī)脫毛備皮。配制各組抗血清原液及其氯化鈉注射液稀釋液(1∶2、1∶4和1∶8稀釋液)，每組將原液及不同稀釋度的抗血清分別于脊柱兩側(cè)脫毛區(qū)內(nèi)進行皮下注射被動致敏大鼠，每點注射0.1 ml，兩點之間相距約2 cm，48 h后分別靜脈注射10 mg/ml卵白蛋白與1%伊文思蘭等體積混合液 1 ml/只激發(fā)。激發(fā)后30 min，處死大鼠，剪取背部皮膚并翻轉(zhuǎn)，測定注射點部位對應(yīng)皮內(nèi)藍斑直徑，直徑在5 mm 以上者判定為陽性，比較各組被動皮膚過敏陽性比例。被動皮膚過敏陽性比例=各組抗血清原液藍斑> 5 mm的動物只數(shù)/各組動物總數(shù)。

1.4.2 加用佐劑對PCA試驗的影響 致敏：取雄性SPF級SD大鼠18只，體質(zhì)量180～220 g，隨機分為6組，每組3只。取5、10、20、40、80及160 mg/ml的OVA溶液與FCA等體積混合均勻后作為致敏液，分別腹腔注射1 ml/只，隔日1次，共3次。首次致敏后第16 d，將動物以25%烏拉坦麻醉后，經(jīng)腹主動脈取血，靜置凝固20 min以上，2 500 r/min離心10 min，分離抗血清原液，將每組動物抗血清混合，-4 ℃保存?zhèn)溆谩Ａ砣⌒坌許PF級SD大鼠36只被動致敏，方法同“1.4.1”。

1.4.3 佐劑用量對PCA試驗的影響 取雄性SPF級SD大鼠18只，體質(zhì)量180～220 g，隨機分為6組，每組3只。分別取FCA與NS按照0.25∶0.75、0.3∶0.7、0.4∶0.6、0.5∶0.5、0.6∶0.4及0.7∶0.3的比例混合，加入適量卵白蛋白混合均勻至其終濃度為10 mg/ml，腹腔注射1 ml/只致敏，隔日1次，共3次。首次致敏后第16 d，將動物以25%烏拉坦麻醉后，經(jīng)腹主動脈取血，靜置凝固20 min以上，2 500 r/min離心10 min，分離抗血清原液，將每組動物抗血清混合，-4 ℃保存?zhèn)溆谩Ａ砣⌒坌許PF級SD大鼠36只被動致敏，方法同“1.4.1”。

1.4.4 動物體質(zhì)量對PCA試驗的影響 ① 致敏動物體質(zhì)量對PCA試驗的影響：分別取體質(zhì)量為200、250、300、350、400及450 g的雄性SPF級SD大鼠各3只，各為1組。將20、25、30、35、40及45 mg/ml的OVA溶液與等體積的FCA混合均勻，分別腹腔注射1 ml/只致敏，隔日1次，共3次。首次致敏后第16 d，將動物以25%烏拉坦麻醉后，經(jīng)腹主動脈取血，靜置凝固20 min以上，2 500 r/min離心10 min，分離抗血清原液，將每組動物抗血清混合，-4 ℃保存?zhèn)溆?。另取雄性SPF級SD大鼠36只被動致敏，方法同“1.4.1”。② 被動致敏動物體質(zhì)量對PCA試驗的影響：取雄性SPF級SD大鼠6只，體質(zhì)量180～220 g。選取20 mg/ml的卵白蛋白溶液與等體積的FCA混合均勻后，動物腹腔注射1 ml/只致敏，隔日1次，共3次。首次致敏后第16 d，將動物以25%烏拉坦麻醉后，經(jīng)腹主動脈取血，靜置凝固20 min以上，2 500 r/min離心10 min，分離抗血清原液，將每組動物抗血清混合，-4 ℃保存?zhèn)溆?。分別取體質(zhì)量為200、250、300、350、400及450 g的雄性SPF級SD大鼠被動致敏，其他操作同“1.4.1”。

1.4.5 致敏時間對PCA試驗的影響 取雄性SPF級SD大鼠36只，體質(zhì)量180～220 g，隨機分為6組，每組6只。將20 mg/ml的卵白蛋白溶液與等體積的FCA混合均勻后，各組動物腹腔注射1 ml/只致敏，隔日1次，共3次。各組依次于首次致敏后第8、10、12、14、16及18日，將動物以25%烏拉坦麻醉后，經(jīng)腹主動脈取血離心分離抗血清原液，每組以6只動物被動致敏，方法同“1.4.1”。

2 結(jié)果

2.1 OVA致敏劑量對PCA試驗的影響 OVA作為抗原，2.5、5、10及20 mg/只的4個劑量組PCA試驗結(jié)果為陰性；OVA 40和80 mg/只的2個劑量組大鼠致敏后背部皮膚非注射點，明顯可見多處散在分布藍斑，直徑均小于5 mm，色澤較淺，40 mg/只時出現(xiàn)比例為3/6，80 mg/只時比例為4/6，而注射點均未見藍斑。結(jié)果表明，不添加佐劑時，OVA作為抗原，2.5、5、10、20、40及80 mg/只的6個劑量組，PCA試驗反應(yīng)均為陰性。結(jié)果見表1。

2.2 加用佐劑對PCA試驗的影響 添加佐劑的情況下，OVA 2.5 mg/只時，PCA試驗即成陽性反應(yīng)，抗血清原液的陽性率為66.7%(4/6)，抗血清稀釋液均呈陰性反應(yīng)。伴隨OVA劑量的逐漸增加，各濃度抗血清的藍斑直徑也逐漸增加，原液的陽性率均為100%(6/6)。5、10、20、40及80 mg/只5個劑量組，各組抗血清1∶2稀釋液的PCA陽性率均可達83.3%(5/6)以上，1∶4稀釋液陽性率均可達50%(3/6)以上。同一劑量OVA下，隨著抗血清稀釋倍數(shù)的增加，藍斑直徑及陽性率均呈抗原濃度依賴性遞減。結(jié)果見表2。

2.3 佐劑用量對PCA試驗的影響 FCA與NS比例為0.25∶0.75時，抗血清原液藍斑直徑最小，陽性率僅為50%(3/6)。伴隨FCA劑量的逐漸增大，抗血清原液藍斑直徑及陽性率增加，0.4∶0.6、0.5∶0.5及0.6∶0.4三個比例組藍斑直徑最大，三者之間相互比較無顯著性差異，各組分別與0.25∶0.75及0.3∶0.7組比較，有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。而0.7∶0.3組藍斑直徑下降，抗血清1∶2稀釋液陽性率下降至66.7%(4/6)。結(jié)果見表3。

2.4 動物體質(zhì)量對PCA試驗的影響

2.4.1 致敏動物體質(zhì)量對PCA試驗的影響 致敏動物體質(zhì)量為200、250及300 g時，抗血清原液藍斑直徑最大，三者相互比較無顯著性差異。體質(zhì)量大于300后，藍斑直徑隨體質(zhì)量增加而縮小，與200 g組相比有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見表4。

2.4.2 被動致敏動物體質(zhì)量對PCA試驗的影響 被動致敏動物體質(zhì)量為200、250及300 g時，抗血清原液藍斑直徑最大，三者相互比較無顯著性差異。體質(zhì)量大于300 g后，藍斑直徑隨體質(zhì)量增加而縮小，與200 g組相比有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見表5。

2.4.3 致敏時間對PCA試驗的影響 致敏12～14 d，藍斑直徑達到最大值，各稀釋濃度藍斑直徑相互比較無顯著性差異。致敏8 d，抗血清原液、抗血清1∶2稀釋液即可產(chǎn)生陽性反應(yīng)，陽性率均為100%，藍斑直徑分別與12～14 d比較均無顯著性差異，提示PCA反應(yīng)致敏時間最短可設(shè)定為8 d。結(jié)果見表6。

表1 OVA致敏劑量對PCA試驗的影響

注：n表示陽性反應(yīng)的動物數(shù)，N表示動物總數(shù)。

表2 加用佐劑對PCA試驗的影響

注：n表示陽性反應(yīng)的動物數(shù)，N表示動物總數(shù)。

表3 佐劑用量對PCA試驗的影響±s)

注： 在同等抗血清稀釋度下與0.25∶0.75組比較，*為P<0.05，**為P<0.01；在同等抗血清稀釋度下與0.3∶0.7組比較，

# 為P<0.05，## 為P<0.01，n表示陽性反應(yīng)的動物數(shù)，N表示動物總數(shù)。

表4 致敏動物體質(zhì)量對PCA試驗的影響±s)

注： 在同等抗血清稀釋度下與致敏動物體質(zhì)量200 g組比較，*為P<0.05，**為P<0.01

n表示陽性反應(yīng)的動物數(shù)，N表示動物總數(shù)。

表5 被動致敏動物體質(zhì)量對PCA試驗的影響±s)

注： 在同等稀釋度下與被動致敏動物體質(zhì)量200 g組比較，*為P<0.05，**為P<0.01

n表示陽性反應(yīng)的動物數(shù)，N表示動物總數(shù)。

表6 致敏時間對PCA試驗的影響

注：n表示陽性反應(yīng)的動物數(shù)，N表示動物總數(shù)。

3 討論

PCA試驗是一個錯綜復(fù)雜的試驗過程，其結(jié)果受多種因素的影響，而《指導(dǎo)原則》中相關(guān)規(guī)定又欠具體，對如何取得良好的實驗結(jié)果造成一定困擾。關(guān)于陽性藥物的使用，《指導(dǎo)原則》中僅規(guī)定為“陽性對照組給予1～5 mg/只牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏陽性物質(zhì)”，再無其他相關(guān)說明。張冬梅等[6]PCA試驗表明，在不添加佐劑的情況下，豚鼠是PCA試驗最為敏感的模型動物，而大鼠PCA試驗結(jié)果為陰性。藍繼奎[7]等試驗結(jié)果也證實，卵白蛋白5 mg/只時PCA結(jié)果為陰性。本試驗于不添加佐劑的情況下，單用OVA 2.5～80 mg/只，包含及遠高于推薦劑量進行試驗，均未能得到陽性反應(yīng)。進一步證實，大鼠的PCA試驗必須添加佐劑，建議《指導(dǎo)原則》中應(yīng)明確表明。另外，本試驗中發(fā)現(xiàn)，在未添加佐劑情況下，卵白蛋白40 mg/只及80 mg/只時，大鼠皮膚處非注射位點散在分布淺色藍斑，直徑均小于5 mm，考慮為產(chǎn)生低滴度抗體所致。

在添加FCA佐劑的情況下，可明顯增加OVA的PCA陽性反應(yīng)。OVA 2.5 mg/只即可產(chǎn)生陽性結(jié)果，但僅有抗血清原液呈陽性反應(yīng)，且藍斑色淺心空而不實。OVA 40 mg/只以上藍斑直徑過大不便區(qū)分界限，因而建議應(yīng)用FCA為佐劑進行PCA試驗時，OVA的用量宜選用5～20 mg/只。

FCA為油性乳劑，與抗原結(jié)合后，延長抗原在局部組織中的停留時間，降低抗原的分解速度，從而增強抗原免疫原性[4]，F(xiàn)CA用量則是影響這一過程的關(guān)鍵因素。FCA未商品化之前，各實驗室以液體石蠟、羊毛脂及卡介苗的配方自行配制，過程極其煩瑣，配得的成品按0.5 ml FCA∶0.5 ml溶媒(以每只動物注射1 ml計算)的推薦比例較難乳化均勻。FCA商品化以后，其可稀釋程度有了較大的改善。0.25 ml FCA∶0.75 ml溶媒為可被乳化的最低比例，但需要研磨較長時間。本試驗結(jié)果表明，該比例下PCA陽性率僅為50%。陽性率不高的原因可能為該比例下乳濁液的不穩(wěn)定性，又或者是研磨時間過長，對OVA的活性造成了一定破壞。在0.4 ml FCA∶0.6 ml溶媒、0.5 ml FCA∶0.5 ml溶媒及0.6 ml FCA∶0.4 ml溶媒三個比例下，PCA藍斑直徑最大，且三者藍斑直徑大小無顯著性差異，表明三種配比方案均可使用。使用0.4 ml FCA∶0.6 ml溶媒的比例用于藥物安全性評價，特別是對于成品注射液，其暴露量較0.5 ml FCA∶0.5 ml溶媒的比例可提高20%。

動物體質(zhì)量也是影響PCA試驗成敗的關(guān)鍵因素之一，本試驗條件下，PCA陽性率隨著致敏動物或被動致敏動物體質(zhì)量增加而出現(xiàn)依賴性降低，應(yīng)與動物的免疫力逐漸下降有關(guān)。依據(jù)本試驗結(jié)果，推薦最佳動物體質(zhì)量為200～300 g，且在該體質(zhì)量下，動物周齡較小，尾部鱗片角質(zhì)化程度較低，也便于激發(fā)給藥時的尾靜脈注射操作。

致敏時間也是影響試驗的關(guān)鍵因素，同時也關(guān)系到試驗的進度。致敏時間短，抗體蛋白難以生成；時間過長，抗體濃度可能會降低，均會造成試驗結(jié)果的假陰性。本試驗研究表明，首次致敏后12～14 d，PCA藍斑直徑可達峰值水平；致敏后18 d，藍斑直徑則具有一定的降低趨勢；致敏后最短8 d，即可出現(xiàn)PCA陽性反應(yīng)，且與藍斑峰值時比較無顯著性差異。綜合考慮到時間與成本等因素，PCA試驗時應(yīng)盡量縮短致敏時間。

綜上所述，本研究分別針對OVA致敏劑量、是否添加佐劑、佐劑用量、致敏及被動致敏動物體質(zhì)量及致敏時間6個因素對PCA試驗結(jié)果的影響進行了系統(tǒng)性研究，進一步完善并甄選出敏感的試驗條件，為提高試驗穩(wěn)定性奠定了良好的實驗基礎(chǔ)。

1 國家食品藥品監(jiān)督管理局.藥物研究技術(shù)指導(dǎo)原則(2005年) [M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2006，252-253

2 安丹，王智琴，由宇潤，等 . 魚腥草注射液的被動皮膚過敏試驗及體外過敏試驗[J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2011，28 (10)：812-817

3 李秀芳，金若敏，符勝光，等 . 不同品系大鼠對天花粉蛋白誘導(dǎo)被動皮膚過敏差異性的比較研究[J]. 中藥新藥與臨床藥理，2010，21(4)：382-385

4 王金華，王瑞峰，高志遠 . 大鼠被動皮膚過敏試驗影響因素的研究[J]. 中國實驗方劑學(xué)，2010，16(18)：160-162

5 梁宗星，郭琳，梁峰，等 . 大鼠被動皮膚過敏試驗方法研究[J]. 毒理學(xué)雜志，2012，26(3)：195-197

6 張冬梅，劉延珍，單淑香，等 . 豚鼠和大鼠被動皮膚過敏試驗[J]. 動物醫(yī)學(xué)進展，2013，34(12)：241-243

7 藍繼奎，徐嘉紅，徐曉玉 . 被動皮膚過敏試驗影響因素初步研究[J]. 中藥藥理與臨床，2008，24(2)：108-109

Study on experiment factors of passive cutaneous anaphylaxis in rats

Wang Chong, Hou Juan, Qi Wenjun, Yu Tong, Ruijing

(Tianjin Institute for Drug Control, Tianjin 300070)

Objective: To determine the optimal conditions for PCA tests to improve both sensitivity and accuracy of the tests by systematically studying the influence factors. Method: PCA experiments, with OVA as an antigen, were carried out under different conditions with an OVA sensitizing dose, with or without adjuvant, adjuvant dose, body weight of animal and sensitizing course. Results: ① In the absence of Freund’s Complete Adjuvant (FCA), no positive results were obtained with OVA within a scope of 2.5 to 80 mg/rat. ② FCA significantly enhanced sensitivity of immune system with OVA in a range of 5 mg/rat to 20 mg/rat. ③ If one milliliter was injected for sensitizing the animals, the following three solutions could be applied: 0.4 ml of FCA in 0.6 ml of the solvent, 0.5 ml of FCA in 0.5 ml of the solvent and 0.6 ml of FCA in 0.4 ml of the solvent. ④ Animals with a body weight of 200 to 300 g were the most sensitive for PCA tests. ⑤ After sensitization for 12 to 14 days, the diameter of dermal Evan’s spot reached the peak, and the shortest sensitizing course was 8 day. Conclusion: In the PCA experiment, we should pay enough attention to the factors mentioned here.

passive cutaneous anaphylaxis, OVA, FCA

2016-06-12

R965.3

A

1006-5687(2016)05-0001-05