同型半胱氨酸對大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞線粒體功能的影響及通心絡的保護作用

孫永輝 位 庚 賈振華 常麗萍

(河北以嶺醫(yī)院，河北 石家莊 050091)

同型半胱氨酸對大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞線粒體功能的影響及通心絡的保護作用

孫永輝1,2,3位 庚1,2,4賈振華1,2,3常麗萍1,2,3

(河北以嶺醫(yī)院，河北 石家莊 050091)

目的探討通心絡(TXL)對同型半胱氨酸(Hcy)誘導大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞線粒體功能損傷的保護作用及機制。方法用Hcy建立大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞損傷模型，分為對照組、Hcy組、TXL-L組、TXL-M組、TXL-H組。分別檢測各組細胞線粒體活性、線粒體膜電位(MMP)和細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平。結(jié)果與對照組相比，模型組細胞線粒體活性和MMP降低，細胞內(nèi)ROS水平升高(P<0.05，P<0.01)；與模型組相比，TXL各濃度組均能不同程度地改善上述指標變化(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論TXL能夠改善Hcy誘導的大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞線粒體功能障礙，其作用機制可能與降低細胞內(nèi)ROS水平有關。

通心絡；心肌微血管內(nèi)皮細胞；同型半胱氨酸；線粒體；活性氧

線粒體是細胞內(nèi)重要的細胞器，存在于大多數(shù)真核細胞中，不僅可以調(diào)節(jié)細胞的能量代謝，還可以調(diào)控細胞的壞死和凋亡，并參與細胞的信號轉(zhuǎn)導。近年研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細胞線粒體功能障礙在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔1〕。中藥復方制劑通心絡(TXL)在脈絡學說指導下研制而成，對心血管疾病的防治療效顯著〔2〕，對血管內(nèi)皮細胞具有明顯的保護作用。本研究選用同型半胱氨酸(Hcy)為誘導因素，損傷原代提取的大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞(RCMECs)，探討TXL對血管內(nèi)皮細胞線粒體功能的保護作用及其可能機制，為TXL防治心腦血管疾病提供實驗數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1動物 2周齡SPF級SD雄性大鼠10只，體重(30±5)g，由北京富豪實驗動物養(yǎng)殖中心提供，實驗動物許可證號：SCXK(京)2011-0012。

1.2藥物及試劑 TXL由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供；ECM培養(yǎng)基套裝(美國Sciencell公司)；CCK-8(Cell Counting Kit-8)細胞增殖-毒性檢測試劑盒(日本同仁化學研究所)；活性氧(ROS)測試盒(南京建成生物工程研究所)；CD31抗體和DyLight?488標記的羊抗小鼠IgG抗體(美國Abcam公司)；JC-1線粒體膜電位分析試劑盒(美國Cayman公司)。

1.3儀器 PrimoVert倒置顯微鏡(德國Zeiss公司)；多功能酶標儀(美國Bio Tek公司)；FACSAriaⅢ超速流式細胞分選系統(tǒng)(美國BD公司)。

1.4方法

1.4.1藥物配制 稱取TXL藥粉適量溶于無血清ECM培養(yǎng)基，超聲促溶20 min，10 000 r/min離心10 min，收集上清液，用0.22 μm無菌微孔濾器過濾除菌，將所得沉淀于60℃加熱烘干，計算實際溶于無血清ECM培養(yǎng)基中的藥物重量，制備成10 mg/ml TXL貯存液，分裝后-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2RCMECs的分離、培養(yǎng)和鑒定 參照文獻〔3〕并加以改進，分離、培養(yǎng)和鑒定RCMECs。提取的原代RCMECs經(jīng)CD31免疫熒光鑒定顯示純度大于95%。

1.4.3細胞分組及處理 將RCMECs隨機分為：①對照組(Control)：細胞正常培養(yǎng)；②Hcy組：培養(yǎng)液含10 mmol/L Hcy；③TXL低濃度組(TXL-L)：培養(yǎng)液含Hcy 10 mmol/L和TXL 100 mg/L；④TXL中濃度組(TXL-M)：培養(yǎng)液含Hcy 10 mmol/L和TXL 200 mg/L；⑤TXL高濃度組(TXL-H)：培養(yǎng)液含Hcy 10 mmol/L和TXL 400 mg/L。

1.4.4CCK-8法檢測RCMECs線粒體活性 取對數(shù)生長期的RCMECs以1.0×108L-1的細胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每組3個復孔，每孔加入100 μl細胞懸液培養(yǎng)24 h后用于實驗。按照“1.4.3”所示處理后，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h，吸棄培養(yǎng)基，加入含有CCK-8的無血清培養(yǎng)基100 μl(CCK-8溶液∶無血清培養(yǎng)基=1∶10)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h，酶標儀檢測450 nm波長處OD值。以Control組OD值作為參照，以各組OD值與Control組OD值的比值進行統(tǒng)計分析。

1.4.5JC-1試劑測定細胞中線粒體膜電位 接種于96孔細胞培養(yǎng)板的RCMECs按“1.4.3”處理結(jié)束后，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h，用JC-1試劑測定細胞中線粒體膜電位，實驗操作步驟嚴格按說明書進行。

1.4.6流式細胞儀檢測細中ROS水平 RCMECs按“1.4.3”處理24 h后棄去上清，PBS清洗細胞2次，加入含DCFH-DA(1∶10 000)的ECM無血清培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育30 min，0.25%的胰酶消化2 min，加入ECM培養(yǎng)基使細胞終止消化，輕輕吹打制成細胞懸液，移入1.5 ml無菌EP管中1 000 r/min離心5 min后棄上清收集細胞，PBS洗滌細胞2次后移至流式管中，用流式細胞儀檢測。

2 結(jié) 果

2.1各組RCMECs線粒體活性比較 與Control組〔(100.00±4.48)%〕比較，Hcy組細胞線粒體活性降低〔(71.65±3.82)%〕(P<0.01)；與Hcy組比較，TXL-H組細胞線粒體活性升高〔(91.72±6.90)%〕(P<0.01)；與TXL-L組〔(77.29±2.35)%〕比較，TXL-H組細胞線粒體活性升高(P<0.05)；與TXL-M組〔(80.12±8.47)%〕比較，TXL-H組細胞線粒體活性升高(P<0.05)。

2.2各組大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞線粒體膜電位比較 與Control組(3.62±0.15)比較，Hcy組細胞線粒體膜電位降低(2.00±0.14)(P<0.01)；與Hcy組比較，TXL-M組(2.52±0.23)和TXL-H組(2.89±0.19)細胞線粒體膜電位升高(P<0.01)；與TXL-L組(2.21±0.02)比較，TXL-M組和TXL-H組細胞線粒體膜電位升高(P<0.05或P<0.01)；與TXL-M組比較，TXL-H組細胞線粒體膜電位升高(P<0.05)。

2.3各組大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞活性氧水平比較 與Control組〔(19.83±2.97)%〕比較，Hcy組細胞ROS水平〔(38.17±10.28)%〕升高(P<0.05)；與Hcy組比較，TXL-H組細胞ROS水平〔(22.50±3.66)%〕降低(P<0.05)。TXL-L、TXL-M組ROS水平分別為(33.83±9.41)%、(30.90±9.83)%。

3 討 論

高Hcy血癥已成為心腦血管疾病的獨立危險因素〔4〕?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，Hcy可引起血管內(nèi)皮細胞損傷〔5〕，誘發(fā)線粒體功能障礙〔6〕。心肌微血管位于循環(huán)系統(tǒng)的末梢，由單層內(nèi)皮細胞和基膜組成，決定心肌灌注水平，在一定程度上影響冠脈儲備。在血管性疾病的發(fā)生過程中，微血管病變的發(fā)生同時或早于其供養(yǎng)的大血管〔7〕，所以微血管內(nèi)皮細胞在心腦血管發(fā)病中的作用逐漸受到人們的重視?！敖j以通為用”為脈絡病變的總體治療原則，TXL是在中醫(yī)絡病理論指導下，結(jié)合氣血相關理論組方而成，由人參、赤芍、降香、全蝎、水蛭、土鱉蟲、蟬蛻、蜈蚣、檀香、酸棗仁、乳香及冰片組成，具有化瘀通絡、益氣活血等功效。大量實驗已證實，TXL不但具有保護血液的作用(抗炎、降脂、減少阿司匹林抵抗)，而且具有保護血管的作用(抑制不穩(wěn)定斑塊、保護血管內(nèi)皮細胞、抑制內(nèi)皮細胞凋亡、解除痙攣)，同時其具有保護心腦血管組織等作用〔8～10〕，臨床研究亦證實其在防治有一定的作用〔11～13〕。

線粒體存在于大多數(shù)細胞中，是細胞進行有氧呼吸的主要場所，對細胞受到的損傷較為敏感。氧化應激、再灌注損傷和Ca2+超載等多種細胞死亡信號的刺激可使橫跨線粒體內(nèi)、外膜的線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔保持持續(xù)開放，通透性增加，使線粒體膜電位下降，導致跨膜的氫離子濃度梯度消失，引起呼吸鏈脫耦聯(lián)，此時線粒體發(fā)生滲透性水腫，外膜破裂，使存在于線粒體內(nèi)的CytC釋放入胞質(zhì)〔14〕，導致線粒體內(nèi)的CytC減少，直接造成了線粒體內(nèi)呼吸鏈電子傳遞的中斷，抑制氧化磷酸化，促進了氧自由基的生成，繼而ATP含量減少，可最終導致細胞損傷乃至壞死〔15〕。本研究表明，Hcy可引起RCMECs線粒體活性降低，而TXL高劑量組可有效抑制細胞線粒體活性下降；并且TXL可有效逆轉(zhuǎn)線粒體的損傷狀態(tài)。ROS是氧元素在體內(nèi)氧化還原反應的產(chǎn)物，其表達量過多導致的氧化應激可直接導致血管內(nèi)皮細胞氧化損傷和功能障礙，ROS還作為信號分子放大和疊加損傷作用〔16，17〕，線粒體不僅是ROS產(chǎn)生的主要位點，更是ROS損傷的主要靶點。本研究顯示，Hcy誘導細胞損傷后，伴隨細胞線粒體功能的損傷，細胞內(nèi)ROS水平也明顯升高，TXL高劑量干預后，細胞內(nèi)ROS水平明顯降低，細胞線粒體功能也隨之改善。

1高 磊，張 欣，劉 越，等.血管內(nèi)皮細胞線粒體動力學相關功能與心血管疾病關系的研究進展〔J〕.心臟雜志，2017;29(1)：105-8.

2劉紅利，郎艷松，王宏濤.通心絡膠囊治療心血管疾病研究進展〔J〕.中國新藥雜志，2014；23(15)：1769-72.

3位 庚，李紅蓉，劉紅利，等.通心絡對大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016；36(6)：709-17.

4Boushey CJ，Beresford SA，Omenn GS，etal.A quantitative assessment of plasma homocysteine as a risk factor for vascular disease.Probable benefits of increasing folic acid intakes〔J〕.JAMA，1995;274(13)：1049-57.

5Dong D，Wang B，Yin W，etal.Disturbance of copper homeostasis is a mechanism for homocysteine-induced vascular endothelial cell injury〔J〕.PLoS One，2015;8(10)：e76209.

6王計良，藺俊文，史澤晉，等.水飛薊素對同型半胱氨酸誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞調(diào)往的抑制作用〔J〕.中國病理生理雜志，2007;23(3)：509-13.

7Camici PG，Crea F.Coronary microvascular dysfunction〔J〕.N Engl J Med，2007;356(8)：830-40.

8Liu Y，Tang GH，Sun YH，etal.The protective role of Tongxinluo on blood-brain barrier after ischemia-reperfusion brain injury〔J〕.J Ethnopharmacol，2013;148(2)：632-9.

9Chen L，Wang X，Chen X，etal.Tongxinluo attenuates neuronal loss and enhances neurogenesis and angiogenesis in the ipsilateral thalamus and improves neurological outcome after focal cortical infarction in hypertensive rats〔J〕.Restor Neurol Neurons，2014;32(4)：533-46.

10Ma L，Liu X，Lu H，etal.Traditional Chinese medication Tongxinluo inhibits inflammatory angiogenesis via Bmx/NF-κB/MAPK pathways〔J〕.Eur Heart J Suppl，2015;17(Suppl B)：B13-22.

11夏 天.通心絡對高同型半胱氨酸血癥合并高血壓患者血管內(nèi)皮的保護作用〔J〕.新中醫(yī)，2015;47(6)：6-8.

12曹 慧，許 曼，蘇曉輝，等.通心絡對急性冠脈綜合征患者同型半胱氨酸的影響〔J〕.江蘇醫(yī)藥，2014;40(9)：1079-80.

13楊 寧，陸 倩.通心絡膠囊對缺血性腦卒中患者血脂、凝血功能、Hcy，CRP水平及生活質(zhì)量的影響〔J〕.疑難病雜志，2011；10(8)：607-8.

14Lang F，Hoffmann EK.Role of ion transport in control of apoptotic celldeath〔J〕.Compr Physiol，2012；2(3)：2037-61.

15Haraguchi M，Torii S，Matsuzawa Si，etal.Apoptotic protease activating factor 1(Apaf-1)-independent cell death suppression by Bcl-2〔J〕.J Exp Med，2000；191(10)：1709-20.

16Case J，Ingram DA，Haneline LS.Oxidative stress impairs endothelial progenitor cell function〔J〕.Antioxid Redox Sign，2008；10(11)：1895-907.

17Ingram DA，Krier TR，Mead LE，etal.Clonogenic endothelial progenitor cells are sensitive to oxidative stress〔J〕.Stem Cells，2007；25(2)：297-304.

〔2016-08-12修回〕

(編輯 郭 菁)

EffectofTongxinluoonhomocysteine-inducedratcardiacmicrovascularendothelialcellsmitochondrialdysfunction

SUNYong-Hui，WEIGeng，JIAZhen-Hua,etal.

YilingHospitalofHebeiProvince，Shijiazhuang050091，Hebei,China

ObjectiveTo observe the protective effects of Tongxinluo(TXL) on homocysteine(Hcy)-induced rat cardiac microvascular endothelial cells (RCMECs) mitochondrial dysfunction, and to determine the mechanism behind its protection.MethodsHcy was used to develop model, the cells were divided into control, Hcy, Tongxinluo low, middle and high groups. The cell mitochondrial activity, mitochondrial membrane potential (MMP), content of adenosine triphosphate(ATP), reactive oxygen species(ROS)level and protein expression of Cytochrome C (Cyt C)were observed.ResultsCompared with those of Control group, cell mitochondrial activity, MMP and ATP concentration were decreased in Hcy group, ROS production and protein expression of Cyt C were increased in Hcy group(P<0.05，P<0.01). Compared with those of Hcy group, the index of different changes of TXL every dose group were improved, and the high concentration of tongxinluo group was the best(P<0.05，P<0.01).ConclusionsTXL could improve Hcy-induced dysfunction of mitochondria in rat cardiac microvascular endothelial cells, and plays a protective role by reducing ROS level in the cells.

Tongxinluo；Cardiac microvascular endothelial cells；Homocysteine；Mitochondria；Reactive oxygen species

R285.5

A

1005-9202(2017)18-4435-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.003

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)(No.2012CB518606)

1 絡病研究與創(chuàng)新中藥國家重點實驗室

2 國家中醫(yī)藥管理局重點研究室(心腦血管絡病)

3 河北省絡病重點實驗室 4 石家莊市第二醫(yī)院

位 庚(1980-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事心血管疾病的研究。

孫永輝(1979-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事心血管疾病的研究。