副豬嗜血桿菌病實(shí)驗(yàn)室診斷方法綜述

魏 鳳，張文通，李 峰，沈志強(qiáng),

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

副豬嗜血桿菌病實(shí)驗(yàn)室診斷方法綜述

魏 鳳1，張文通2，李 峰1，沈志強(qiáng)1,2

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

副豬嗜血桿菌病是引起呼吸系統(tǒng)疾病的重要傳染病之一，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展。正確診斷副豬嗜血桿菌病對(duì)防治該病極為關(guān)鍵。本文就該病病原分離鑒定、血清學(xué)診斷、分子生物學(xué)診斷三方面展開闡述，以期弄清該病診斷方面的研究進(jìn)展。

副豬嗜血桿菌；診斷方法；綜述

副豬嗜血桿菌?。℉PS）是豬的一種傳染性病癥，以呼吸困難、多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎為主要特征。該病主要影響2周齡到4月齡的青年豬。感染豬群主要在斷奶前后和保育階段發(fā)病，通常見于5～8周齡的豬，發(fā)病率達(dá)20%～30%，嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)50%以上。該病隨著養(yǎng)豬集約化發(fā)展，再加上免疫抑制病（如豬圓環(huán)病毒2型病毒病、豬繁殖與呼吸綜合征等），目前在我國流行日趨嚴(yán)重[1-3]。預(yù)防該病所用的疫苗由于血清型之間的差異，交叉保護(hù)率低，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的損失，已成為影響?zhàn)B豬業(yè)最重要細(xì)菌性疾病之一。

防治該病的關(guān)鍵措施之一是對(duì)該病病原的確診。依靠對(duì)發(fā)病豬群的病史、臨床癥狀、剖檢病變這些傳統(tǒng)診斷方法可以進(jìn)行初步診斷，但弄清病原乃至病原的血清型必須依靠實(shí)驗(yàn)室診斷。自1922年Schermer和Ehrlich分離出該病原以來，科研工作者對(duì)該病確診進(jìn)行了大量的研究，取得了顯著成績。本文就該病實(shí)驗(yàn)室診斷方法的研究進(jìn)展進(jìn)行了如下綜述。

1 細(xì)菌分離鑒定

細(xì)菌的分離培養(yǎng)對(duì)確診是十分有必要的，但往往因雜菌的干擾而不能分離成功。

細(xì)菌分離鑒定時(shí)應(yīng)當(dāng)采集處于疾病急性期的豬并且沒有使用抗生素的病料，無菌操作條件下采集病豬肺臟、關(guān)節(jié)液、淋巴結(jié)等組織，通常在接種于含NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)的巧克力瓊脂平板。在含血清和NAD的TSA（胰蛋白胨大豆瓊脂）培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，可以觀察到針尖大小、圓形、光滑濕潤、無色透明、邊緣整齊的菌落。革蘭氏染色后顯微鏡下觀察，為革蘭氏陰性細(xì)小桿菌。在無菌操作條件下，挑取上述可疑菌落，水平劃線接種于無 NAD 的綿羊鮮血平皿上，再挑取金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線，37 ℃培養(yǎng) 24～48 h后，觀察其在葡萄球菌周圍生長情況，應(yīng)出現(xiàn)“衛(wèi)星生長現(xiàn)象”且無溶血現(xiàn)象[3-4]。

2 血清學(xué)診斷

副豬嗜血桿菌病血清學(xué)的診斷方法主要包括補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CF)，平板凝集試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)(IHA)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。

補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)，用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)方法檢測副豬嗜血桿菌的抗體，發(fā)現(xiàn)在補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中各種血清型之間具有廣泛的交叉反應(yīng)性。

高艷等利用副豬嗜血桿菌陜西分離株制備平板凝集抗原，用其免疫健康家兔制備血清抗體，建立副豬嗜血桿菌平板凝集檢測方法。采用本試驗(yàn)建立的副豬嗜血桿菌平板凝集試驗(yàn)方法對(duì)臨床血清樣品的檢測結(jié)果與臨床診斷結(jié)果基本一致。

魏子貢等用超聲波破碎的副豬嗜血桿菌血清4型和血清5型抗原代替副豬嗜血桿菌煮沸物或熱酚水透析物，用醛化鞣酸化的綿羊紅細(xì)胞代替新鮮綿羊紅細(xì)胞，經(jīng)對(duì)免疫豬群的抗體水平檢測，免疫豬群2周后抗體檢出率達(dá)89%；對(duì)1 665份豬血清進(jìn)行檢測，陽性率為47.1%。該方法敏感性較高，特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，可用于疫苗免疫后抗體水平的檢測及副豬嗜血桿菌的流行病學(xué)調(diào)查。石碧等建立了用莢膜多糖作為包被抗原的間接血凝方法，通過優(yōu)化莢膜最佳生長條件，得到了高質(zhì)量的抗原，從而使抗體檢測的敏感性得到了大大的提高。而Miniats等曾用副豬嗜血桿菌0322株鹽水浸出抗原致敏綿羊紅細(xì)胞檢測陽性血清，結(jié)果表明IHA法與間接ELISA檢測法符合率為65.3%。

李鵬等利用純化融合P2蛋白作包被抗原及優(yōu)化ELISA反應(yīng)條件，建立了可檢測抗HPS P2蛋白抗體的間接ELISA方法，并用所建立的P2-ELISA與國外進(jìn)口的HPS檢測試劑盒Synbiocits-ELISA對(duì)196份臨床送檢血清進(jìn)行平行檢測，陽性符合率為93.4%。臧瑩安等利用副豬嗜血桿菌OMP P5基因表達(dá)并純化復(fù)性后蛋白作為包被蛋白，建立針對(duì)副豬嗜血桿菌外膜蛋白P5的間接ELISA抗體檢測方法， 通過對(duì)進(jìn)行和未進(jìn)行 HPS免疫的健康豬血清的檢測，證實(shí)了建立的間接ELISA方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)快速準(zhǔn)確等特點(diǎn)，可用于HPS的快速診斷。鄭念廣等采用121 ℃高壓處理副豬嗜血桿菌4型和5型耐熱蛋白，混合作為包被抗原，建立了檢測副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法。結(jié)果表明敏感性比間接血凝試驗(yàn)高與國外ELISA試劑盒一致，可用于副豬嗜血桿菌的血清抗體檢測和血清流行病學(xué)調(diào)查。馮小明等采用超聲裂解的副豬嗜血桿菌菌體上清作為包被抗原,建立了檢測副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法。建立的間接ELISA方法的特異性和重復(fù)性良好,敏感性比間接血凝試驗(yàn)高,可用于副豬嗜血桿菌的檢疫和流行病學(xué)調(diào)查 。

3 分子生物學(xué)檢測

在動(dòng)物傳染性疾病的診斷研究中，分子生物學(xué)方法的引入，大大提高了診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性，特別是對(duì)一些生長緩慢的病原體所致的疾病的診斷的發(fā)展。

根據(jù)副豬嗜血桿菌16S rRNA序列設(shè)計(jì)的引物建立的PCR診斷方法可以從臨床樣品中檢測出副豬嗜血桿菌，這種方法檢測的最小細(xì)菌濃度為102CFU/mL，其敏感性也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)的細(xì)菌分離方法。劉建奎等針對(duì)副豬嗜血桿菌16 S rRNA序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，并據(jù)此建立了快速準(zhǔn)確鑒定副豬嗜血桿菌PCR方法，13份疑似病料檢測結(jié)果表明，PCR檢測結(jié)果與傳統(tǒng)生化鑒定結(jié)果符合率為100%。

車勇良等建立一種可快速檢測副豬嗜血桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）方法。是常規(guī)PCR檢測最低限的100倍，顯示出較高的敏感性。

2013年，李富祥等根據(jù)副豬嗜血桿菌16 S rRNA基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，建立了副豬嗜血桿菌TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法。結(jié)果表明，該方法最低可檢測到6.92×101copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品陽性質(zhì)粒；臨床樣品檢測結(jié)果表明，該方法可用于副豬嗜血桿菌感染的早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查以及副豬嗜血桿菌的定量分析。羅寶正等參考 GenBank 已發(fā)表的副豬嗜血桿菌轉(zhuǎn)錄起始因子infB基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立基于TaqMan探針熒光PCR技術(shù)檢測副豬嗜血桿菌的方法。結(jié)果表明 TaqMan 探針熒光 PCR 方法和細(xì)菌分離方法的檢測效果一致。

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2017-03-17）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目 SDAIT-08-17

魏鳳，女（1979-），河南遂平人，碩士，助理研究員，主要從事獸用生物制品研究，E-mail：hzndzwt1@163.com