山羊急性咳喘的病原體檢測

王友剛 羅永光 杜光波

（淮安生物工程高等職業(yè)學校，江蘇淮安 223200）

山羊急性咳喘的病原體檢測

王友剛 羅永光 杜光波

（淮安生物工程高等職業(yè)學校，江蘇淮安 223200）

在流行病學調查、臨床診斷、病理剖檢的基礎上，對一家肉羊場發(fā)生的羊群急性咳喘、急性死亡的病例進行病原實驗室分離鑒定、PCR檢測，確診為一起以綿羊支原體感染為主的羊傳染性胸膜肺炎。

山羊 咳喘 病原檢測 羊傳染性胸膜肺炎

近年來，淮安地區(qū)肉羊規(guī)模養(yǎng)殖發(fā)展迅速，幾百頭到數(shù)千頭規(guī)模養(yǎng)羊場如雨后春筍般的出現(xiàn)。隨著規(guī)?；⒓s化肉羊養(yǎng)殖發(fā)展，羊在高密度舍飼情況下，疫病風險顯著增加，尤其是許多養(yǎng)殖戶為了短期內擴張羊場規(guī)模，隨意引種，導致羊場病原多樣化、復雜化。

2016年8月，淮安某羊場因為盲目引種，導致一場較大規(guī)模疫病流行，損失嚴重。經過流行病學調查、臨床診斷、病理剖檢和實驗室檢測，確定了主要病原，制定了中西醫(yī)結合防治方案，及時控制了疫病，現(xiàn)將病原檢測情況報告如下：

1 發(fā)病情況

淮安某羊場飼養(yǎng)了356頭波雜種羊和538頭波雜羊育肥羊，羊群接種過了山羊傳染性胸膜肺炎疫苗、羊痘疫苗、三聯(lián)四防疫苗和小反芻獸疫疫苗。2016年8月份，又從外地收購25～30kg的土種山羊300頭，飼養(yǎng)于場里獨立一間羊舍，沒有和本場羊群混合。外地羊群入場后第3d開始，連續(xù)有羊發(fā)生咳嗽氣喘、流膿樣鼻涕和零星死亡，第7d起，病情突然加重，羊群出現(xiàn)普遍發(fā)呆、發(fā)熱、氣喘和劇烈咳嗽，每天死亡17～20頭，經過當?shù)孬F醫(yī)治療，效果一直不明顯。第10d，發(fā)現(xiàn)本場原有的羊群也開始出現(xiàn)氣喘、咳嗽和流膿樣鼻涕。

2 實驗室準備

2.1 試劑

血瓊脂平板培養(yǎng)基、含精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基、含精氨酸支原體瓊脂固體培養(yǎng)基都購于百思生物科技公司。

2.2 設備

二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱、全自動高壓滅菌鍋、全自動熒光PCR檢測儀及其配套試劑盒，由淮安生物工程高等職業(yè)學校羊病檢測中心提供。

3 診斷

3.1 詢問疫情

查看獸醫(yī)治療記錄、防疫記錄、疫苗、使用的藥品和治療效果。

3.2 臨床檢查

現(xiàn)場觀察臨床癥狀、聽診和檢測體溫。

3.3 尸體剖檢

現(xiàn)場解剖病死羊5頭。

3.4 病料采集

無菌采集病死羊病變肺部組織、氣管分泌物、胸腔積液、心包積液、心血、肝臟、脾臟、腎臟；無菌采集活的病羊血液。

3.5 病原體檢測

3.5.1 病原體分離培養(yǎng)

（1）培養(yǎng)基制備

含精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基 稱取本品25.52g，加熱溶解于800ml蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min，冷至室溫，無菌操作加入滅活小牛血清200ml和青霉素80萬IU，混勻，分裝無菌試管備用。

含精氨酸支原體瓊脂固體培養(yǎng)基 取支原體瓊脂基礎培養(yǎng)基45g、蒸餾水1000ml加熱溶解，121℃高壓滅菌15min后，待冷卻至55℃左右加入預熱到55℃的小牛血清100ml、青霉素80萬IU，混勻，無菌分裝平皿。以上培養(yǎng)基4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）分離培養(yǎng)

將采集的新鮮病料去除漿膜，無菌采集深層組織1小塊，再加少量的生理鹽水混合，在滅菌的玻璃研磨器里研磨勻漿，將勻漿液分裝于1.5ml的EP管3000r/min離心2min，取0.3μm接種于血瓊脂平板培養(yǎng)基，再取上清液再經0.45μm濾膜過濾后，取0.3ml分別接種于支原體肉湯培養(yǎng)基、支原體瓊脂平板培養(yǎng)基，放置于二氧化碳培養(yǎng)箱，控制5%二氧化碳，37℃，加濕，培養(yǎng)7d，其間不斷觀察細菌生長情況。當液體呈橘黃色時，按1：5的接種量盲傳兩次，直至培養(yǎng)物變?yōu)辄S色，將變黃的培養(yǎng)物畫線接種于固體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，挑取單個典型菌落純化3次后，獲得純培養(yǎng)物。

（3）涂片鏡檢

分別取肉湯和瓊脂平板上的純培養(yǎng)物涂片，瑞士和革蘭氏染色染色鏡檢。

3.5.2 PCR檢測

將無菌采集的病死羊心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟，研磨后反復凍融3次，勻漿器磨細，收集勻漿，12000r/min離心10min，取上清液，并與采集的羊血清一起分別進行快速熒光PCR檢測。

4 體會

4.1 治療效果

當?shù)孬F醫(yī)曾經使用青霉素、鏈霉素、恩諾沙星、氟苯尼考進行注射和口服，治療效果不明顯，沒有緩解癥狀，死亡日益增加。

4.2 臨床癥狀

發(fā)病羊表現(xiàn)精神沉郁，食欲廢絕，步態(tài)蹣跚，呼吸困難，張口伸脖，咳嗽，痛苦呻吟，有的倒地不起，四肢平展，口流黏液，鼻腔有膿樣鼻涕，體溫40℃～41.5℃，聽診肺部有明顯濕羅音和摩擦音，部分羊眼瞼腫脹、流淚，口腔黏膜有潰瘍，有些羊有腹瀉癥狀。

4.3 病理變化

解剖5頭病死羊，病變比較一致，主要病變?yōu)?，胸腔積液多而渾濁，肺嚴重肝變，切面較硬，呈現(xiàn)大理石樣，局部有灰黃色壞死區(qū)域，有些部位有化膿灶，胸膜和肺粘連，心包增厚，外有多量纖維樣物質，心包積液。食道、真胃、盲腸、結腸近端和直腸未見條狀充血、出血現(xiàn)象，其他器官也無明顯病理變化。

4.4 實驗室病原檢測

4.4.1 分離培養(yǎng)

支原體肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)48h變?yōu)殚冱S色，72h變?yōu)辄S色。支原體瓊脂培養(yǎng)基24～48h無可見菌落，72h有針尖大小露珠樣菌落，96h，菌落稍微變大，放大鏡下觀察，呈現(xiàn)扁平煎蛋狀。血瓊脂平板培養(yǎng)基，72h也長出針尖大小露珠狀菌落，沒有其他菌落出現(xiàn)。

4.4.2 涂片鏡檢

取純培養(yǎng)物涂片革蘭氏染色和瑞氏染色鏡檢，可見細小桿狀、球形、卵圓形、環(huán)狀等多形態(tài)微小菌體；革蘭氏染色陰性。

4.4.3 PCR檢測結果

經過快速熒PCR檢測，結果血清和病料提取液中，都含有綿羊支原體。

5 討論

該羊場羊群肺炎急性流行，經過臨床癥狀、病理變化、病原分離和PCR檢測，確診為綿羊支原體感染。但是，羊急性肺炎病因比較復雜，病原較多，主要有支原體、巴斯德菌、鏈球菌等等。由于病原分離所取的病料，都是來源于已經注射過多種抗菌藥物的病羊，有可能還有其他病原體混合感染，因為多種抗生素的注射，可能已經殺死了其他混合感染的細菌，而支原體對所注射的抗菌藥物有耐藥性，所以血瓊脂培養(yǎng)基只有支原體生長，沒有其他細菌生長，這不代表沒有其他病原混合感染的可能。

該羊場本次肺炎急性流行，主要是由于盲目收購散養(yǎng)戶羊群，引進帶菌羊，加上環(huán)境應激而引起發(fā)的以羊支原體感染為主的肺炎的暴發(fā)。羊場其他羊群雖然已經進行了山羊傳染性胸膜肺炎疫苗注射，但是，仍然有部分羊群感染，主要原因是疫苗毒株是山羊支原體而不含綿羊支原體，本次感染的是綿羊肺炎支原體。山羊傳染性胸膜肺炎是由山羊支原體引起的一種高度接觸性傳染病。其臨床特征是以高熱、咳喘、急性纖維性肺炎和胸膜炎。發(fā)病率為22%～30%，有的地區(qū)高達60%～80%，死亡率為15%～30%，對世界各國的養(yǎng)羊業(yè)帶來巨大的損失。國內外研究結果表明，引起山羊傳染性胸膜肺炎的支原體有多種，我國羊傳染性胸膜肺炎病原主要為絲狀支原體山羊亞種和綿羊肺炎支原體。

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淮安地區(qū)肉羊規(guī)模養(yǎng)殖常見疫病預防技術研究與推廣；（SXGC[2015]156）防治羊大腸桿菌病的微生態(tài)中藥制劑的研制（HAN2015029）