牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)研究進(jìn)展

薛 麒 吳思捷 張瑩輝 康 凱 印春生 姚文生 陳小云

（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081）

牛病毒性腹瀉病毒檢測(cè)研究進(jìn)展

薛 麒 吳思捷 張瑩輝 康 凱 印春生 姚文生 陳小云*

（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081）

牛病毒性腹瀉病給養(yǎng)牛業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失，檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒對(duì)于養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展非常重要。本文綜述了近年來(lái)檢測(cè)牛病毒性病毒的檢測(cè)方法，并歸納這些方法的優(yōu)缺點(diǎn)。建議檢測(cè)人員結(jié)合該病診斷檢測(cè)的實(shí)際需要，合理使用牛病毒性腹瀉病毒的各種檢測(cè)方法。

牛病毒性腹瀉病毒 檢測(cè) 進(jìn)展

0 引言

牛病毒性腹瀉又稱牛黏膜病，是由牛病毒性腹瀉病毒引起的牛發(fā)生黏膜發(fā)炎、糜爛、壞死和腹瀉的一種急性傳染病。牛病毒性腹瀉病毒（Bovine Viral Diarrhea virus，BVDV），又名黏膜病病毒（Mucosal Disease virus，MDV）屬于黃病毒科瘟病毒屬，與豬瘟病毒在基因結(jié)構(gòu)和抗原特性存在高度同源。牛病毒性腹瀉給養(yǎng)牛業(yè)造成了很大的危害，同時(shí)該病病毒也能感染豬、山羊等其他動(dòng)物，給該病的預(yù)防診斷造成很多困難。

1 病原學(xué)檢測(cè)

1.1 病毒分離鑒定

病毒分離鑒定是一種常見(jiàn)檢測(cè)BVDV的方法，多種牛源細(xì)胞如牛腎、脾、睪丸和氣管等細(xì)胞均可用于該病毒的分離。其中牛腎細(xì)胞（MDBK）是用于分離BVDV最常用的細(xì)胞之一。病毒分離依據(jù)BVDV引起的典型細(xì)胞病變來(lái)判斷，根據(jù)病毒對(duì)細(xì)胞的致病性將BVDV分為致細(xì)胞病變型（CP型）和非致細(xì)胞病變型（NCP型）。通常將病料接種于牛腎細(xì)胞（MDBK）等細(xì)胞培養(yǎng)物中，盲傳幾代后觀察細(xì)胞的病變情況。但這種分離培養(yǎng)方法只適用于致細(xì)胞病變型的BVDV的分離鑒定，對(duì)于非細(xì)胞致病變型的無(wú)法通過(guò)細(xì)胞病變情況來(lái)判斷，需要通過(guò)其他診斷方法進(jìn)一步檢測(cè)。包振中等在新疆北疆地區(qū)采集到BVDV疑似病例的糞便，通過(guò)細(xì)胞分離培養(yǎng)，接種于密度約為80%的單層MDBK細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞病變，盲傳5代至出現(xiàn)BVDV典型的細(xì)胞病變。侯佩莉等也從BVDV疑似病牛的糞便中分離得到一株病毒能使MDBK細(xì)胞才產(chǎn)生細(xì)胞病變，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步鑒定證實(shí)，確定該病毒為BVDV。鄧宇等將處理后的BVDV陽(yáng)性仔豬組織樣品接種于MDBK細(xì)胞，分離得到一株豬源BVDV，命名為SD0803株，該株在MDBK細(xì)胞上盲傳至13代，沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞病變。但在直接免疫熒光試驗(yàn)中呈陽(yáng)性，PCR檢測(cè)證實(shí)為BVDV，故該毒株為非細(xì)胞致病變型。

1.2 電鏡觀察鑒定

電鏡技術(shù)是病毒學(xué)研究和病毒診斷的技術(shù)之一，電鏡技術(shù)對(duì)病毒粒子的數(shù)量要求比較高，最低數(shù)量要達(dá)到107個(gè)/ml。包振中等對(duì)分離得到的BVDV通過(guò)免疫電鏡觀察到大量呈球形的BVDV粒子，大小為20～40nm。趙月蘭等也在奶牛場(chǎng)BVDV疑似病例中采集病料，分離培養(yǎng)后，用電鏡觀察到圓形、直徑為40～60nm，有囊膜，囊膜表面有突起的病毒粒子，與BVDV顆?；疽恢隆?/p>

2 血清學(xué)檢測(cè)

2.1 中和試驗(yàn)

中和試驗(yàn)是牛病毒性腹瀉病流行病學(xué)特異性抗體的檢查方法之一。對(duì)疑似病牛間隔2～4周分兩次采血，血清倍比稀釋后進(jìn)行中和試驗(yàn)，檢查血清中和抗體效價(jià)，滴度升高4倍以上即判定為陽(yáng)性。這種方法不僅能定性檢測(cè)還能定量，其檢出率較瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)高，重復(fù)率好，適用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。此外，也可使用細(xì)胞水平上的中和試驗(yàn)，即用已知的BVDV與被檢血清作用后接種細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變情況。這種方法適用于BVDV流行病學(xué)調(diào)查。

2.2 免疫瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

免疫瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)通常采用未經(jīng)處理的發(fā)炎或糜爛組織周圍的黏膜，直接與BVDV陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，也可取待檢血清與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性抗原進(jìn)行抗體檢測(cè)。該方法簡(jiǎn)單易行，在國(guó)內(nèi)基層獸醫(yī)應(yīng)用廣泛，但其不具備株特異性，準(zhǔn)確率不高，易造成漏檢。

2.3 免疫過(guò)氧化物酶技術(shù)

免疫過(guò)氧化物酶（IP）技術(shù)可應(yīng)用于檢測(cè)BVDV抗原的總體分布、檢測(cè)和血清抗體的檢測(cè)，是可靠的牛病毒性腹瀉病診斷方法之一。Katz等建立了一種用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物BVDV感染的間接免疫過(guò)氧化酶染技術(shù)。感染的單層細(xì)胞被濃染，而沒(méi)有感染的單層細(xì)胞無(wú)色，顯微鏡和肉眼都可以觀察。該技術(shù)方法具有良好的敏感性和特異性。

2.4 免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)是運(yùn)用抗原與抗體結(jié)合的原理和特殊的標(biāo)記技術(shù)，對(duì)特異性抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量檢測(cè)的一門(mén)技術(shù)。通常使用直接免疫熒光法檢測(cè)感染細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒粒子，熒光顆粒出現(xiàn)于胞漿中，并可用未標(biāo)記抗體進(jìn)行熒光抑制試驗(yàn)做進(jìn)一步鑒定。此外，也可使用間接免疫熒光法檢測(cè)血清中的抗體。該技術(shù)方法具有敏感性高、速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適合檢查NCP型的BVDV細(xì)胞培養(yǎng)物，但由于存在非特異性染色的情況，會(huì)導(dǎo)致結(jié)果判定發(fā)生偏差，同時(shí)因?yàn)榧夹g(shù)操作較為復(fù)雜和對(duì)儀器設(shè)備的要求較高，因此不適用于基層獸醫(yī)的實(shí)際檢測(cè)。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是用物理方法將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，用酶標(biāo)記抗原或抗體，使抗原抗體在固相載體發(fā)生反應(yīng)，通過(guò)免疫酶測(cè)定來(lái)判斷結(jié)果。ELISA是檢測(cè)BVDV以及體內(nèi)抗體水平的一種良好技術(shù)。范晴等用兔抗BVDV多抗作為包被抗體，BVDVNS3單克隆抗體作為捕獲抗體，建立了檢測(cè)BVDV抗原的捕獲ELISA方法。特異性和敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法對(duì)牛輪狀病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛分支桿菌無(wú)特異性交叉反應(yīng)，其最低可檢測(cè)7.9×105個(gè)TCID50的病毒量，與RT-PCR方法的相比較，符合率為100%。所建立的BVDV抗原捕獲ELISA方法快速、特異、敏感，可用于BVDV抗原的檢測(cè)。張寧等采用辛酸-硫酸銨法提取兔抗BVDV高免血清中的免疫球蛋白IgG，在混合硝酸纖維素膜上進(jìn)行間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，建立了檢測(cè)BVDV抗原的斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法。應(yīng)用建立的檢測(cè)方法對(duì)78份腹瀉奶牛血樣進(jìn)行了檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率為58.97%；經(jīng)卡方（χ2）檢驗(yàn)分析，建立的間接Dot-ELISA與瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）法相比較，陽(yáng)性檢出率差異顯著。證實(shí)該方法敏感性高、簡(jiǎn)便快速，適合于基層獸醫(yī)的檢測(cè)診斷。李文文等]將2種BVDV：CP型（BVDVOregonC24株）和NCP型（BVDVYak株），滅活、濃縮作為抗原，分別免疫家兔制備高免血清，同時(shí)使用BVDV全病毒蛋白作為包被原，建立了檢測(cè)BVDV的間接ELISA檢測(cè)方法。通過(guò)間接ELISA檢測(cè)方法比較了兩種細(xì)胞致病型的免疫原性。柴順秀等用BVDV重組E2蛋白為包被抗原，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記葡萄球菌A蛋白（PPA）為二抗，建立了檢測(cè)BVDV血清抗體的E2-PPA-ELISA方法。通過(guò)重復(fù)性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)和敏感性試驗(yàn)證明，與用BVDV全病毒為抗原的IDEXXELISA試劑盒相比，建立的E2-PPA-ELISA抗體檢測(cè)方法具有較好的重復(fù)性、敏感性和特異性。對(duì)285份不同地區(qū)采集的血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率為33.4%，與IDEXXELISA試劑盒的檢出率無(wú)明顯差異。表明該方法為BVDV的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供一種快速、簡(jiǎn)便的血清學(xué)診斷方法，適合規(guī)?；B(yǎng)牛場(chǎng)BVDV的抗體監(jiān)測(cè)以及流行病學(xué)調(diào)查。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)

3.1 核酸雜交技術(shù)

核酸雜交技術(shù)是20世紀(jì)80年代興起的一種分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，包括DNA印記雜交和RNA印跡雜交。其原理是把DNA或RNA轉(zhuǎn)移固定在硝酸纖維素膜上，與其互補(bǔ)的單鏈DNA或RNA探針用放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記。與血清學(xué)等傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，核酸雜交技術(shù)應(yīng)用廣泛，敏感性高，特異性強(qiáng)。早期的放射性同位素標(biāo)記探針，其具有放射性危害、不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。后來(lái)發(fā)明的生物素標(biāo)記的DNA探針雖然不具有放射性危害，但其特異性和敏感性有時(shí)均不如放射性同位素標(biāo)記探針?，F(xiàn)在較多使用地高辛標(biāo)記核酸探針，其敏感性不僅與同位素標(biāo)記探針相當(dāng)，特異性又明顯高與生物素標(biāo)記探針。王偉利等建立了地高辛標(biāo)記核酸探針檢測(cè)BVDV的診斷方法。根據(jù)BVDV基因序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在編碼非結(jié)構(gòu)蛋白p125高度保守基因區(qū)內(nèi)，設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物，以PCR技術(shù)從BVDV基因重組質(zhì)粒中擴(kuò)增出了BVDV特異的、保守的400bp核苷酸片段，經(jīng)純化后，地高辛標(biāo)記，制備BVDV的特異性核酸探針。通過(guò)檢測(cè)BVDV細(xì)胞培養(yǎng)物、相關(guān)病毒及核酸載體和BVDV細(xì)胞培養(yǎng)物的總RNA、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及RT-PCR產(chǎn)物，結(jié)果證明，該探針特異性強(qiáng)、敏感性高，適于病毒反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測(cè)。

3.2 轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）

根據(jù)已知的BVDV的基因序列設(shè)計(jì)合成一對(duì)或數(shù)對(duì)引物，用RT-PCR方法可以高度靈敏、特異快速地檢測(cè)待檢物中的BVDV。該方法可以有效檢測(cè)出BVDV，同時(shí)也能區(qū)分細(xì)胞病變型，也能與其他同屬病毒區(qū)別。王偉利等實(shí)時(shí)定量熒光參考BVDV5’端非結(jié)構(gòu)蛋白基因序列，設(shè)計(jì)合成1對(duì)特異性引物，建立檢測(cè)BVDV244bp片段的RT-PCR一步法。該方法對(duì)BVDVNADL、Oregon C24V和長(zhǎng)春184毒株各標(biāo)準(zhǔn)毒株檢測(cè)，結(jié)果均為陽(yáng)性。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)毒株的細(xì)胞毒進(jìn)行檢測(cè)，其敏感度達(dá)0.1TCID50；而對(duì)牛傳染性鼻氣管炎病毒、豬瘟病毒、牛輪狀病毒和牛冠狀病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。檢測(cè)460份不同樣品，與病毒分離試驗(yàn)比較，符合率100%，證明該方法特異性強(qiáng)，敏感性高。李晶梅等Gen Bank上牛病毒性腹瀉病毒和豬瘟病毒兩種病毒標(biāo)準(zhǔn)株的基因組序列，選取各自的保守基因區(qū)域設(shè)計(jì)可以進(jìn)行鑒別檢測(cè)的特異性引物，經(jīng)過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了可以對(duì)2種病毒同時(shí)檢測(cè)的雙重RT-PCR方法。該方法對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬日本腦炎病毒、豬偽狂犬病病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬圓環(huán)病毒2型的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；該檢測(cè)方法的敏感性為5ng病毒基因組RNA。所建立的這種雙重RTPCR檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、敏感性高，可以用于兩種疾病的檢測(cè)，也為兩種病毒的交叉污染的檢測(cè)提供一種方便、快捷的方法。王克棟等根據(jù)Gen Bank已發(fā)表的BVDV基因1型和2型毒株的5’端非編碼區(qū)（5’-UTR）保守序列的差異，設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物，并以牛GAPDH基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，建立BVDV分型與內(nèi)標(biāo)三重RT-PCR檢測(cè)方法。3對(duì)引物可分別擴(kuò)增出的片段大小為127、94、152bp，與預(yù)期大小相符。經(jīng)反應(yīng)條件優(yōu)化，該方法的靈敏度為100TCID50，與不加內(nèi)標(biāo)檢測(cè)靈敏度相當(dāng)。經(jīng)臨床樣品檢測(cè)驗(yàn)證，該方法具有較好的特異性和重復(fù)性，可用來(lái)對(duì)BVDV分型進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)。

3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。郭銳等以BVDV的保守基因序列，設(shè)計(jì)、優(yōu)化出一對(duì)特異性引物和一條Taq Man熒光探針，簡(jiǎn)歷了一種快速定量檢測(cè)BVDV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。該方法檢測(cè)靈敏度比RT-PCR高100倍，同時(shí)避免了普通PCR電泳檢測(cè)帶來(lái)的污染。張淑琴等在BVDV5’端非編碼區(qū)（5’-UTR）設(shè)計(jì)并合成了1對(duì)引物，建立了可以定量檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒核酸的SYBRGreenⅠ熒光定量PCR方法。該方法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2為0.999，擴(kuò)增效率為95.9%，熔解曲線為單一峰值，可檢測(cè)到初始模板中4.1×101copies/μL的牛病毒性腹瀉病毒核酸，是常規(guī)RTPCR方法敏感性的100倍。陳其兵等同樣也根據(jù)BVDV基因序列設(shè)計(jì)合成引物和Taq Man熒光探針，建立了熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)20份胎牛血樣和豬瘟細(xì)胞苗半成品的檢測(cè)，該方法具有快速、特異、靈敏和重復(fù)性好等特點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)跟常規(guī)RT-PCR 方法相比，其特異性更強(qiáng)，能有效解決PCR污染問(wèn)題，其自動(dòng)化程度也比較高，但該方法對(duì)儀器要求高，有時(shí)存在假陽(yáng)性的情況。

4 小結(jié)

隨著各種檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，BVDV的檢測(cè)在不斷完善和進(jìn)步。如免疫膠體金的應(yīng)用促進(jìn)了病毒檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，在BVDV的檢測(cè)研究中也在不斷進(jìn)步。BVDV的檢測(cè)對(duì)養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要，各種檢測(cè)技術(shù)各有優(yōu)劣，需要結(jié)合實(shí)際加以運(yùn)用，正確地檢測(cè)牛群中BVDV的情況，減少牛病毒性腹瀉病帶來(lái)的損失。

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十三五國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目“牛羊重要疫病診斷與檢測(cè)新技術(shù)研究”（2016YFD0500906）

薛 麒，男，研究實(shí)習(xí)員。

陳小云，男，副研究員。