牛支原體實(shí)驗(yàn)室檢測方法研究進(jìn)展

莊金秋，梅建國，劉吉山，姚春陽，馬力(山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600)

牛支原體實(shí)驗(yàn)室檢測方法研究進(jìn)展

莊金秋，梅建國，劉吉山，姚春陽，馬力
(山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600)

隨著規(guī)模化養(yǎng)牛業(yè)的不斷發(fā)展，牛支原體已經(jīng)成為危害養(yǎng)牛業(yè)的一種重要致病性支原體，可導(dǎo)致牛肺炎、乳腺炎、關(guān)節(jié)炎等多種疾病，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本文綜述了牛支原體病原學(xué)、血清學(xué)及分子生物學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)室檢測方法研究進(jìn)展，以期為我國牛支原體病的防治提供參考。

牛支原體；檢測；研究進(jìn)展

牛支原體（Mycoplasma bovis，M. bovis）屬支原體科支原體屬，是一種介于細(xì)菌和病毒之間的無細(xì)胞壁的原核微生物。M. bovis可引起犢牛肺炎、乳腺炎、關(guān)節(jié)炎、角膜結(jié)膜炎、耳炎、生殖道炎甚至流產(chǎn)與不孕等多種疾病，這些疾病常被稱為牛支原體相關(guān)疾病（Mycoplasma bovis-associated disease，MbAD）。牛傳染性胸膜肺炎（Contagious bovine pleuropneumonia，CBPP）簡稱牛肺疫，是由與M.bovis同屬的絲狀支原體絲狀亞種SC型（Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC，MmmSC）引起的烈性傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為須通報(bào)的動(dòng)物疫病。M. bovis是繼MmmSC對(duì)牛致病力最強(qiáng)的支原體，二者具有相似的臨床癥狀和病理剖檢變化，不易鑒別診斷。1961年Hale在美國首次從一例患乳腺炎患牛的牛乳中分離出M. bovis[1]。1976年美國首次報(bào)道M. bovis引起的肺炎。我國黎濟(jì)申等[2]于1983年從患乳腺炎的牛乳中首次分離到該病原，辛九慶等[3]于2008年從患肺炎的犢牛肺臟中首次分離到該病原。M. bovis是危害犢牛的重要致病性病原體，具有較高的感染率和死亡率，而經(jīng)治療后癥狀緩解的牛一般發(fā)育遲緩，甚至成為廢牛，嚴(yán)重影響牛奶的產(chǎn)量和質(zhì)量。該病呈世界性分布，近年來MbAD已經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，且M.bovis感染后可明顯增加其他病原的繼發(fā)感染，給世界養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。牛支原體感染后無特殊癥狀，因此很難對(duì)該病進(jìn)行感官判斷，確診需借助實(shí)驗(yàn)室診斷。本文綜述了近年來M. bovis感染最新實(shí)驗(yàn)室檢測方法研究進(jìn)展，以期對(duì)疾病的預(yù)防控制提供參考。

1 牛支原體分離鑒定

支原體分離鑒定方法應(yīng)嚴(yán)格按照無菌操作規(guī)程，將患病動(dòng)物的組織病料接種于培養(yǎng)基中。支原體培養(yǎng)營養(yǎng)需求較高，通常要在培養(yǎng)基中加入10%～20%馬血清，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5d。在類胸膜肺炎微生物（Pleuropneumonia like organism，PPLO）固體培養(yǎng)基中進(jìn)行分離培養(yǎng)時(shí)，在光學(xué)顯微鏡下，菌落呈現(xiàn)典型的“煎蛋狀”形態(tài)，邊緣整齊，表面光滑，為中間厚周邊薄的菌膜斑點(diǎn)。如若7d未發(fā)現(xiàn)生長跡象，可判斷為陰性。初步鑒定后，在含酚紅的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基顏色是否由紅變黃，且稍渾濁，而后根據(jù)配套的生化反應(yīng)進(jìn)行鑒定。常用的液體培養(yǎng)基包括Hayfiick、Edward、Frey、MEM-KMZ、SP-4等培養(yǎng)基。M. bovis對(duì)外界環(huán)境要求較高，采集病料如未能及時(shí)送往實(shí)驗(yàn)室，則極易導(dǎo)致病原死亡。病料一般需冷藏運(yùn)輸，運(yùn)輸時(shí)間不要超過24h，也可將其凍存于運(yùn)輸培養(yǎng)基中進(jìn)行運(yùn)輸。對(duì)于病料的采集，下呼吸道分離出病原的概率一般比上呼吸道大。雖然牛支原體分離鑒定可以確診是否有M. bovis的感染，但是其分離難度大且周期長，不能作為快速診斷M. bovis感染的有效方法來使用。

2 血清學(xué)方法

血清學(xué)方法是檢測M.bovis感染的可靠方法，尤其對(duì)于經(jīng)抗生素治療或慢性病例，血清抗體檢測方法比病原培養(yǎng)方法更敏感。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

利用全菌抗原或重組抗原建立的間接ELISA方法是檢測血清抗體的首選方法，應(yīng)用最為廣泛。用處理過的M.bovis全菌蛋白作為包被抗原的間接ELISA方法不僅能夠檢測血清抗體，還可以檢測患有乳腺炎奶牛的乳清抗體，此方法被廣泛應(yīng)用于M.bovis感染的流行病學(xué)調(diào)查，但是該方法的抗原為全菌蛋白，其特異性有待提高。基于此，Brank等[4]建立了以M.bovis的VSP重組蛋白作為包被抗原的間接ELISA方法，Robino等[5]建立了以M.bovis的膜脂蛋白P48作為包被抗原的間接ELISA用以檢測對(duì)應(yīng)抗體。Fu等[6]利用P48重組蛋白作為包被抗原，其相應(yīng)的單克隆抗體用HRP進(jìn)行標(biāo)記，建立了直接競爭ELISA檢測M.bovis抗體的方法，與其他兩種商品化ELISA試劑盒比較，該方法具有更好的特異性和更高敏感性。以P48蛋白作為包被抗原的ELISA方法能檢測M.bovis的所有分離株，但是不與感染牛的其他支原體發(fā)生反應(yīng)，在檢測M.bovis感染上有很好的應(yīng)用前景。Wawegama等[7]鑒別出一種可以具有脂肪酶活性的膜蛋白（mycoplasma immunogenic lipase A，MilA），該蛋白氨基末端與M. bovis抗體有很強(qiáng)的免疫反應(yīng)，利用大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)該段蛋白建立了間接ELISA方法，敏感性達(dá)到92.86%，特異性高達(dá)98.7%。金云云等[8]以M.bovis全菌蛋白經(jīng)超聲波裂解后的裂解物作為包被用抗原，建立了檢測M.bovis血清抗體的間接ELISA方法。Han等[9]基于全菌蛋白建立了一種間接ELISA方法，特異性好，而且可以區(qū)分出感染牛和免疫牛，從而可以判斷牛感染程度高低、疫苗有效與否。國外商品化的檢測M. bovis抗體的ELISA試劑盒有瑞士、加拿大和比利時(shí)等國家研制的試劑盒。國內(nèi)劉洋等[10]將純化后的P28重組蛋白作為抗原建立了檢測M.bovis血清抗體的間接ELISA方法并組裝成試劑盒，填補(bǔ)了國內(nèi)ELISA試劑盒的空白。該試劑盒具有良好的敏感性、特異性和穩(wěn)定性，能在一次反應(yīng)中對(duì)M.bovis和MmmSC作鑒別診斷，與加拿大商品化試劑盒的檢測結(jié)果符合率高達(dá)92%，各種技術(shù)指標(biāo)相當(dāng)，認(rèn)為可作為進(jìn)口試劑盒的替代品用于M.bovis的臨床診斷與流行病學(xué)調(diào)查。

2.2 間接血凝試驗(yàn)（IHA）

IHA是一種經(jīng)典的免疫學(xué)診斷技術(shù)，因其操作簡單、穩(wěn)定、成本低，具有較高的敏感性和特異性，且對(duì)試驗(yàn)條件要求低，可被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測、田間血清學(xué)調(diào)查和基層獸醫(yī)部門的輔助診斷。簡瑩娜等[11]以純化的P48重組蛋白致敏醛化-鞣酸化的綿羊紅細(xì)胞并對(duì)其工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立了檢測M. bovis抗體的IHA方法。該方法與國外商品化的ELISA試劑盒比較，平均符合率為96.15%。對(duì)833份田間血清和1 084份乳清進(jìn)行檢測，陽性率分別是15.37%和19.56%。該方法敏感性高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好，可用于M. bovis抗體水平監(jiān)測、牛支原體病的輔助診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

2.3 膠體金免疫層析試紙條

簡瑩娜[12]利用牛支原體P48重組蛋白，建立了檢測M. bovis抗體的膠體金免疫層析試紙條。應(yīng)用該試紙條檢測臨床血清200份，乳清108份，陽性率分別是21.50%、17.59%，與IHA方法相比符合率為96.53%。表明該試紙條敏感、特異、快速，適合于M. bovis抗體的快速檢測。

2.4 免疫組化技術(shù)

免疫組化技術(shù)是一門將免疫學(xué)與組織化學(xué)相結(jié)合的技術(shù)，可在組織細(xì)胞原位通過抗原-抗體特異性結(jié)合反應(yīng)和組織化學(xué)顯色反應(yīng)、借助可見的標(biāo)記物對(duì)相應(yīng)抗原或抗體進(jìn)行定位、定性和定量檢測，不僅能準(zhǔn)確地判斷是否有病原感染，而且還能清晰地反映病原在組織器官和細(xì)胞中的定位及分布。該方法操作簡便、不需要專門的儀器設(shè)備，適合于基層臨床的快速診斷，并且對(duì)于研究病原在機(jī)體內(nèi)的致病機(jī)制及分布規(guī)律有一定的輔助作用。Adegboye等[13]基于單克隆抗體建立了免疫組化方法檢測犢牛肺組織中的M.bovis，與殊異支原體陽性、牛鼻支原體陽性以及牛支原體陰性的牛組織切片等沒有交叉反應(yīng)，且直觀反映出病原的分布。Haines等[14]建立了M.bovis免疫組化技術(shù)，對(duì)牛場M.bovis感染所致的急慢性呼吸道疾病、肺炎、乳腺炎等進(jìn)行了病原體檢測，其檢測結(jié)果提示，病原體數(shù)量、定植部位與病理損傷程度、致病機(jī)理等之間可能存在聯(lián)系。Khodakaram-Tafti等[15]采用免疫組化方法進(jìn)行M.bovis的診斷，不僅能對(duì)福爾馬林固定的組織進(jìn)行M.bovis檢測，還能清楚地顯示出M.bovis在病灶內(nèi)的具體位置，該方法能夠定位抗原、直觀地觀察病變組織的病理變化以及M.bovis侵襲機(jī)體后的分布情況。金云云等[16]以雞抗M.bovis IgY為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG為二抗，建立了檢測M.bovis的間接免疫組化法。該方法可用于檢測臨床病例組織樣本及培養(yǎng)物中的M.bovis，為探究該病原在機(jī)體內(nèi)的定位、動(dòng)態(tài)分布規(guī)律及致病機(jī)理提供了手段。

2.5 其他血清學(xué)方法

其他血清學(xué)檢測方法有應(yīng)用兔源高免疫血清鑒定M.bovis的抗體檢測方法，包括生長抑制試驗(yàn)（GI）、生物膜形成抑制試驗(yàn)（FI）、熒光抗體試驗(yàn)（FA）和新陳代謝抑制試驗(yàn)（MI）等。由于這些試驗(yàn)無商品化抗血清，需在實(shí)驗(yàn)室自行制備，因此操作時(shí)較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

3 分子生物學(xué)方法

由于牛在養(yǎng)殖場環(huán)境中停留2～4周后都存在可檢測滴度的M.bovis抗體，所以血清學(xué)檢測方法無法對(duì)牛肺炎病例是否由M.bovis引起進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷。分子生物學(xué)方法相對(duì)快捷方便，而且靈敏度高，已被廣泛應(yīng)用于M.bovis的實(shí)驗(yàn)室檢測。

3.1 PCR技術(shù)

早期Hotzel等[17]、Ayling等[18]利用PCR方法擴(kuò)增16S rRNA用來檢測M. bovis的感染，但是由于M.bovis與無乳支原體（Mycoplasma agalactiae，M.agalactiae）的16S rRNA同源性高達(dá)99.8%，在不結(jié)合其他方法的情況下無法區(qū)分這兩種病原的感染。于是Johansson等[19]通過16S rRNA的PCR和酶切系統(tǒng)來鑒別這兩種支原體。Subramaniam等[20]選取了DNA修復(fù)基因uvrC作為靶基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增，可以直接應(yīng)用于臨床患病牛的病原學(xué)檢測。Pinnow等[21]建立了套式PCR的方法，能夠快速、準(zhǔn)確地鑒定是否由M.bovis引起的乳腺炎。Bashiruddin等[22]建立了ATP結(jié)合蛋白o(hù)ppD/F基因作為靶基因的PCR方法。Foddai[23]等根據(jù)M.bovis的p81基因，設(shè)計(jì)建立了多重PCR和PCR-RFLP方法，能夠在一次反應(yīng)中對(duì)M.bovis和M.agalactiae作鑒別診斷。我國從2008年開始對(duì)M. bovis進(jìn)行深入研究，P81蛋白是M.bovis和M. agalactiae共有的蛋白，但兩者的同源性僅為67%。李媛等[24]根據(jù)P81基因引物，建立了PCR方法。該方法可以從人工感染牛的鼻拭子和臨床發(fā)病牛肺中擴(kuò)增出目的片段，與分離培養(yǎng)結(jié)果完全符合，為國內(nèi)首次建立的敏感、特異、快速的牛支原體PCR檢測方法。同年利用oppD/F為靶基因，設(shè)計(jì)2對(duì)引物，建立了套式PCR檢測方法，成功鑒別了M.bovis和M. agalactiae。李彥芹[25]利用通用引物擴(kuò)增16S rRNA建立了能夠快速鑒別診斷MmmSC、M.bovis、M. agalactiae和綿羊肺炎支原體的多重PCR方法，可以對(duì)臨床病例中懷疑支原體感染的病料進(jìn)行病原診斷。劉洋等[26]建立了可以同時(shí)鑒別檢測M.bovis 和MmmSC的雙重PCR方法，為我國的牛肺疫認(rèn)證以及M. bovis相關(guān)疾病診斷提供了技術(shù)支持。李大偉等[27]也建立了一種可一次性區(qū)分上述三種支原體的三重PCR方法，用于臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查。胡國明[28]根據(jù)牛支原體P48基因設(shè)計(jì)引物，建立了M.bovis與M.agalactiae、MmmSC、滑液支原體、雞毒支原體等病原的PCR鑒別診斷方法，經(jīng)對(duì)西固、臨洮、武威等地的臨床病料進(jìn)行檢測，證明具有很高的特異性和敏感性，對(duì)M.bovis感染的臨床快速、準(zhǔn)確診斷具有較高的實(shí)用價(jià)值。

3.2 熒光定量PCR技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)也被用于M.bovis檢測的研究。Cai等[29]應(yīng)用雜交探針和退火溫度建立了擴(kuò)增16S rRNA基因序列的實(shí)時(shí)定量PCR方法，用于檢測奶牛牛乳以及肺組織中的M.bovis。在檢測牛乳時(shí)，其敏感性達(dá)100%，檢測肺組織時(shí)，其敏感性達(dá)96.6%。Sachse等[30]針對(duì)oppD基因，設(shè)計(jì)了實(shí)時(shí)定量PCR引物及探針，在患乳腺炎及呼吸道疾病的病牛中，能夠靈敏特異地鑒別出M.bovis，檢測限能夠達(dá)到100cfu/mL。Rossetti等[31]根據(jù)uvrC基因設(shè)計(jì)引物，建立了實(shí)時(shí)定量PCR方法，該方法不需要處理牛乳及組織樣品即可獲取純化的DNA，可直接用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測，具有良好的特異性和高度敏感性，方便用于M.bovis的檢測。

3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)

LAMP方法具有操作簡便、快速、高效、敏感、特異、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，適于基層實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測的廣泛使用。Saito等[32]利用LAMP對(duì)肺炎支原體進(jìn)行檢測，相同時(shí)間內(nèi)LAMP檢測法的靈敏度遠(yuǎn)高于實(shí)時(shí)定量PCR法。在對(duì)70例患者及25例正常人咽試紙檢測中，陽性率100%，無假陽性。Churchward等[33]同時(shí)用競爭性ELISA、套式PCR及LAMP對(duì)絲狀支原體進(jìn)行診斷，結(jié)果顯示，LAMP法的敏感性遠(yuǎn)高于競爭性ELISA和套式PCR。國內(nèi)白智迪[34]、侯軒等[35]先后根據(jù)M.bovis的uvrC基因設(shè)計(jì)引物，建立了LAMP方法，敏感性較PCR方法高100倍。在對(duì)167個(gè)臨床鼻拭子樣本的檢測中，LAMP方法檢測結(jié)果的陽性率（26.95%）高于PCR方法檢測結(jié)果的陽性率（19.16%）。金云云等[36]根據(jù)P81基因設(shè)計(jì)引物建立了LAMP方法，最低檢出限為1.1ng/L。

3.4 雙向電泳技術(shù)

陳維等[37]成功建立了M.bovis蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳技術(shù)，由于國際上目前尚無M.bovis蛋白組學(xué)的相關(guān)報(bào)道，所以該方法的建立，可以鑒定出相應(yīng)的致病性蛋白，為M.bovis致病機(jī)理的研究提供了蛋白質(zhì)組學(xué)信息。

4 小結(jié)

隨著規(guī)?；B(yǎng)牛業(yè)的不斷發(fā)展，牛支原體病的流行范圍越來越廣，發(fā)生頻率也越來越高，嚴(yán)重威脅了我國養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展?，F(xiàn)階段國內(nèi)外對(duì)該病原的研究還不透徹，特別是對(duì)牛支原體疫苗及其遺傳穩(wěn)定性的研究幾乎處于零階段，加之我國對(duì)于本病的研究起步較晚，并且國際上尚無公認(rèn)的特異性診斷方法，以及目前對(duì)于該病致病機(jī)制的研究尚未達(dá)成共識(shí)，從而為該病的預(yù)防控制帶來了不便。因此建立快速、準(zhǔn)確的檢測方法，開發(fā)新型疫苗等防控產(chǎn)品，是控制該病發(fā)生的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，具有十分重要的意義。上述M.bovis的各種檢測方法各有優(yōu)點(diǎn)和實(shí)用性，實(shí)際應(yīng)用中需根據(jù)不同的場合、條件等選擇使用其中的一種或者多種方法。隨著人們對(duì)M.bovis研究的深入，相信現(xiàn)有的檢測方法將不斷得到改進(jìn)，更簡便化、快速化和準(zhǔn)確化的檢測方法也將很快被研制出來。

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Research Progress on the Detection Methods of Mycoplasma Bovis

ZHUANG Jin-qiu, MEI Jian-guo, LIU Ji-shan, YAO Chun-yang, MA Li
(Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy, Binzhou 256600)

With the development of cattle movement, Mycoplasma bovis has been became an important pathogen to damage to the breeding. Associated with a number of bovine diseases, Mycoplasma bovis is the most commonly implicated in pneumonia and mastitis, form which arthritis may result, so that it bright a huge economic loss. This paper summarized the research progress on the detection of the Mycoplasma bovis in terms of etiology, serological and molecular biology so as to provide references for prevention and control of Mycoplasma bovis infection in China.

Mycoplasma bovis; Detection; Research progress

S858.23

A

1004-4264（2017）02-0030-05

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.02.008

2016-07-29

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系牛產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-09-12）；山 東 省 重 點(diǎn) 研 發(fā) 計(jì) 劃 項(xiàng) 目（2015GSF121027）。

莊金秋（1978-），女，山東濰坊人，碩士，副研究員，主要從事細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物用病毒疫苗研制工作。