高致病性禽流感抗體的檢測與控制

左 韜

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052; 2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十師畜牧獸醫(yī)站,新疆北屯 836099)

高致病性禽流感抗體的檢測與控制

左 韜1，2

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052; 2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十師畜牧獸醫(yī)站,新疆北屯 836099)

1 動物免疫抗體監(jiān)測的重要性

動物免疫抗體監(jiān)測是通過免疫血清學(xué)的方法對免疫后動物抗體水平的測定，根據(jù)免疫監(jiān)測的結(jié)果來檢驗(yàn)免疫成效的一種技術(shù)方法。檢測免疫動物抗體水平，是檢驗(yàn)免疫效果，掌握疫情動態(tài)的最直接、最有效的方法，動物的免疫抗體水平，可以為防控重大動物疫病提供科學(xué)的依據(jù)。

2 疫苗

禽流感疫苗是使用禽流感病毒通過增殖后滅活或者人工致弱，以及基因重組等措施，人工制造的用來防控高致病性禽流感的一類疫苗統(tǒng)稱。按照生產(chǎn)工藝和制作方法的不同，可將禽流感疫苗分為以下多種：全病毒滅活疫苗、基因工程重組病毒滅活疫苗，基因工程亞單位疫苗、反向遺傳疫苗、基因重組活載體疫苗、核酸疫苗、表位疫苗、轉(zhuǎn)基因植物疫苗、冷適應(yīng)流感弱毒疫苗、基因工程活流感病毒疫苗、復(fù)制缺陷型流感病毒疫苗等。

新疆地區(qū)多使用re-5株，re-6株生產(chǎn)的基因重組滅活禽流感疫苗，例如H5N1禽流感滅活苗、H5+H9二價滅活苗。

禽流感滅活疫苗免疫家禽后產(chǎn)生禽流感病毒抗體，來抵御外界同種亞型的禽流感野毒的侵襲，避免發(fā)生大規(guī)模疫病?；蛘咄ㄟ^注射疫苗，建立屏障和緩沖區(qū)域，對疫情進(jìn)行封鎖、包圍和撲滅。由于飼養(yǎng)家禽個體素質(zhì)的差異、養(yǎng)殖場所的管理水平、防疫人員的專業(yè)素養(yǎng)和疫苗的質(zhì)量與運(yùn)輸環(huán)境的不同。因而造成被免疫動物產(chǎn)生的免疫抗體效價不同，從而抵抗外界病毒侵襲的能力不同，檢測被免疫動物抗體水平，為防控重大動物疫病提供科學(xué)的依據(jù)。

本文論述主要依照GB/T18936-2003 高致病性禽流感診斷技術(shù)論述試驗(yàn)過程。

3 禽流感防控措施

3.1 建立科學(xué)的免疫程序

規(guī)模場家禽出欄時間短，而需要防控的傳染病種類較多，因此要求規(guī)模場的家禽在有限的時間內(nèi)進(jìn)行多次免疫，這就要求養(yǎng)殖場制定出適合本場情況的免疫程序。免疫程序受著母源抗體和、免疫時間、免疫方法、疫苗種類、免疫次數(shù)和當(dāng)?shù)匾卟×餍星闆r等因素的影響。因此，應(yīng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的抗體監(jiān)測結(jié)果.選擇最低抗體效價最低的時間作為再次免疫時間，選擇了合適的免疫時機(jī)，就會大大增加免疫成功的概率。

3.2 利用檢測數(shù)據(jù)，評估免疫效果

免疫動物整體抗體效價合格率、抗體效價均勻度、抗體維持時間是免疫質(zhì)量的重要內(nèi)容，與是否發(fā)生疫病直接相關(guān)。完成抗體監(jiān)測后，及時通知監(jiān)測區(qū)域所屬鄉(xiāng)（鎮(zhèn)），對整體免疫合格率達(dá)不到70%以上水平時，及時補(bǔ)免，并調(diào)查分析影響免疫成功的因素和原因，收集外界信息，提高工作理論水平。

3.3 評價禽流感疫苗質(zhì)量

在免疫前和免疫后2～3 周對免疫動物采血進(jìn)行抗體檢測并將抗體水平檢測結(jié)果進(jìn)行比對?？梢源_認(rèn)免疫效果，同時通過每隔2-4周1次的抗體檢測可以確定免疫有效保護(hù)持續(xù)時間.從而客觀有效地評價疫苗質(zhì)量。

3.4 重大動物疫病預(yù)警

禽流感病毒有兩種纖突：血凝素有15個亞型。神經(jīng)氨酸酶，有9個亞型。各種HA和NA都存在基因重組的可能。目前造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的有（1）H7N7、H3N8馬流感1型、二型；（2）H1N1及 H3N8來源于豬；（3）H4N5，H7N7來源于患病海豹；（4）H10N4來源于病貂；（5）H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H3N8引起人類呼吸道疾病；（6）幾乎所有的神經(jīng)氨酸酶NA和血凝素（HA）的組合都在禽類中發(fā)現(xiàn)，尤其是H5N1、H5N2、H7N1，以及H9N2引起“禽流感”。以及伊犁地區(qū)的H5N6高致病性禽流感。

家禽自然感染禽流感各種亞型病毒一段時間或者康復(fù)后.會在一定時間段帶有該病原較高效價的抗體。檢測到禽流感某亞型病毒特異性抗體后.可以初步確定該地區(qū)有家禽已感染或者是感染過某種疫病。對抗體檢測呈陽性的動物.輔以病原學(xué)檢測.對較早的發(fā)現(xiàn)禽流感疫情，動物疫病防控預(yù)警、制定防控措施有很好的幫助。

4 工作體會

4.1 保證高致病性禽流感抗體監(jiān)測的準(zhǔn)確性

抗原效價測定：必須使用無禽流感抗體的公雞紅細(xì)胞，不同種屬動物紅細(xì)胞對抗原效價測定有影響。

禽流感抗原首次使用時應(yīng)分裝多瓶后凍藏，每次使用時需要測定抗原效價。配制好的四倍禽流感抗原液需要及時使用，放置在4℃冰箱內(nèi)抗原效價會下降。檢測抗原效價可多檢測幾行，取抗原效價整數(shù)平均值。抗原效價測定完成后務(wù)必回歸四倍抗原試驗(yàn)。

（1）被檢血清的保存與稀釋：被檢血清需冷凍保存。檢樣時確實(shí)吸取被檢血清50μl至每列第一孔。對于膠凍狀血清，檢測時盡量不吸取其中膠凍成分，以免出現(xiàn)跳孔或抗體效價不合格，確實(shí)無法吸取血清的樣品略過不檢（無檢測價值）。

（2）添加抗原與作用時間：配制抗原的時間最好安排在被檢血清稀釋完成后，當(dāng)次配制抗原當(dāng)次使用。禽流感抗體檢測最好批量完成，這樣在配制抗原的過程中，減少誤差，增強(qiáng)試驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性。

（3）添加紅細(xì)胞與結(jié)果判定：紅細(xì)胞采集工作最好一次足量，避免再次采集使用來與不同紅細(xì)胞而測定抗原效價耽誤試驗(yàn)時間；沖洗、儲存紅細(xì)胞的器具經(jīng)過滅菌后使用，紅細(xì)胞在4°冰箱內(nèi)可保存一周。測定抗原效價紅細(xì)胞與檢測所用紅細(xì)胞應(yīng)一致。重新采集紅細(xì)胞時需另測抗原效價。配制1%紅細(xì)胞懸液時需要按照標(biāo)準(zhǔn)配置，紅細(xì)胞濃度過高造成多量紅細(xì)胞沉積在孔底，對讀板造成影響；濃度過低也不便于讀板。

4.2 減少試驗(yàn)中的錯誤和誤差

4.2.1 錯誤

（1）在加樣中出現(xiàn)錯誤：批量操作中第12孔空白對照只加入25ul PBS磷酸鹽緩沖液。添加4倍抗原的過程中重復(fù)添加某一列或者漏加某一列。造成跳孔或者無法順利讀出試驗(yàn)結(jié)果。

試驗(yàn)人員沒有掌握數(shù)量的操作技術(shù)導(dǎo)致試驗(yàn)失敗、監(jiān)測任務(wù)多且任務(wù)集中，時間短，在高強(qiáng)度的作業(yè)壓力下，發(fā)生錯誤不能有效處理。又有多人操作，試劑的配置和保存以及使用出現(xiàn)用錯液體或者試劑的情況。

（2）4倍抗原配制、使用錯誤：

圖省事，使用上次測定抗原效價來配制當(dāng)次試驗(yàn)用4倍抗原液；配制4倍抗原液后因故無法繼續(xù)試驗(yàn)，而不棄去抗原液留待下次使用的。

4.2.2 誤差

誤差是正常試驗(yàn)中因?yàn)閭€人因素導(dǎo)致的試驗(yàn)結(jié)果不同的現(xiàn)象，誤差可以減小，但不能避免。

（1）檢測樣品數(shù)量很少時，按照實(shí)際用量測算抗原使用量配制4倍抗原，此種配制方法誤差較大，不檢疫使用。

（2）判定標(biāo)準(zhǔn)不一致：

禽流感抗體檢測后的試驗(yàn)結(jié)果判定過程中有一定的主觀性，因此要求，一次的試驗(yàn)數(shù)據(jù)最好由一人判定完成，多人判定造成判定標(biāo)準(zhǔn)不一致，從而增加誤差的范圍。

4.3 數(shù)據(jù)理論

（1）形成良好的實(shí)驗(yàn)室工作習(xí)慣，實(shí)驗(yàn)前后及時登記實(shí)驗(yàn)室環(huán)境數(shù)據(jù)，使用儀器前后及時登記，配制試劑溶液如實(shí)填寫試劑配制信息。

（2）按照實(shí)際情況記錄試驗(yàn)結(jié)果，出現(xiàn)錯誤和誤差時勇于追求真相，根據(jù)試驗(yàn)記錄和試驗(yàn)信息仔細(xì)查找出現(xiàn)錯誤和誤差的原因，積極提高試驗(yàn)操作水平和理論水平。

（3）合理利用試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行防疫效果評估，流行病學(xué)調(diào)查等工作，利用試驗(yàn)數(shù)據(jù)，解決防疫人員和養(yǎng)殖場所的疑惑，并給予科學(xué)合理的答疑。

5 抗體效價數(shù)據(jù)的意義

5.1 合格：抗體效價合格率達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)的大于等于70%

按照相關(guān)資料和農(nóng)業(yè)部的免疫合格要求，禽流感群體免疫效價達(dá)到70%以上，可以抵御禽流感病毒的侵襲，能夠產(chǎn)生屏障作用。

5.2 不合格：抗體效價合格率低于70%的國家標(biāo)準(zhǔn)

按照農(nóng)業(yè)部《高致病性禽流感禽流感防控標(biāo)準(zhǔn)》，群體免疫合格率低于70%的，要及時補(bǔ)免，保證長年免疫合格率在70%以上。

（1）再次對試驗(yàn)試劑名稱、廠家、批號和試驗(yàn)過程進(jìn)行復(fù)核，確認(rèn)試劑使用正確，保存條件適合，試驗(yàn)中未有操作失誤，抗原對照，空白對照皆成立。

（2）出具檢測報告書或者提出整改意見，立即通知被檢單位（場所）或防疫員及時進(jìn)行補(bǔ)免，補(bǔ)免21日后重新抽血進(jìn)行檢測。

（3）補(bǔ)免21日經(jīng)檢測仍不合格，考慮疫苗運(yùn)輸保存過程中是否全程處在冷鏈中，防疫人員領(lǐng)取疫苗后是否采取有效的保溫措施，當(dāng)日當(dāng)次疫苗長期室溫放置或者疫苗經(jīng)陽光暴曬會導(dǎo)致疫苗免疫原性喪失，致使免疫失敗。

血清反應(yīng)板是否按要求已沖洗干凈并滅活，一次性反應(yīng)板質(zhì)量不達(dá)標(biāo)。

6 提高免疫合格率的一些措施

（1）按照出現(xiàn)問題的不同采用不同的解決方式，免疫抑制、改變免疫程序（對待母源抗體）、冷鏈斷裂，進(jìn)行技能培訓(xùn)，配置冷藏疫苗箱。設(shè)立獎懲制度。完善冷鏈設(shè)施設(shè)備。以及責(zé)任追究。

（2）重新補(bǔ)注疫苗后，兩周后重新采血檢測。嚴(yán)肅認(rèn)真的態(tài)度，保證后續(xù)免疫工作的認(rèn)真負(fù)責(zé)。

（3）應(yīng)當(dāng)配備一定的免疫副反應(yīng)基金，減少因免疫出現(xiàn)死亡而產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)糾紛，減輕防疫員工作壓力。