豬乙型腦炎病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法研究進(jìn)展

莊金秋，梅建國(guó)，張 穎，莫 玲，李 峰，沈志強(qiáng)

（濱州市畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600）

豬乙型腦炎病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法研究進(jìn)展

莊金秋，梅建國(guó)，張 穎，莫 玲，李 峰，沈志強(qiáng)

（濱州市畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600）

豬乙型腦炎嚴(yán)重危害著人類健康，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了極大經(jīng)濟(jì)損失。本文從血清學(xué)和病原學(xué)方面入手，綜述了豬乙型腦炎病毒最新實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法研究進(jìn)展，以期為該病的預(yù)防與控制提供參考。

豬乙型腦炎；日本腦炎病毒；檢測(cè)方法；研究進(jìn)展

豬乙型腦炎（Japanese encephalitis，JE）又稱流行性乙型腦炎、日本乙型腦炎，簡(jiǎn)稱乙腦，是由黃病毒科黃病毒屬的日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的一種嚴(yán)重的蚊媒性人獸共患病毒性疾病。該病毒主要通過攜帶病毒的蚊蟲叮咬傳播，豬是其主要增殖宿主和擴(kuò)散宿主。該病可導(dǎo)致妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或弱仔，公豬睪丸炎，育肥豬持續(xù)高熱，新生仔豬呈神經(jīng)癥狀等，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的蟲媒病之一，目前尚無特效治療藥物，嚴(yán)重威脅著人類的健康。對(duì)豬進(jìn)行疫苗免疫可以有效減少JEV對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成的危害，同時(shí)對(duì)JEV進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)具有十分重要的意義。本文詳細(xì)綜述了豬乙型腦炎病毒近年來的檢測(cè)方法研究進(jìn)展，以期為快速診斷和防治該病提供參考。

1 血清學(xué)檢測(cè)方法

1.1 凝結(jié)性試驗(yàn)

1.1.1 血凝抑制試驗(yàn)（HI）。該法是流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷中最常用的方法。JEV HI抗體出現(xiàn)較早，一般在發(fā)病后4～5 d開始出現(xiàn)，2周左右達(dá)到髙峰，可維持1年左右。因此測(cè)定HI抗體可用于早期診斷。HI抗體存在于IgM和IgG免疫球蛋白中，IgM出現(xiàn)在早期，因此鑒定動(dòng)物抗體是IgM還是IgG有早期診斷意義。如果是IgM，表示該動(dòng)物是新近感染；若不是IgM，則說明該動(dòng)物早就被感染。HI試驗(yàn)敏感性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，但對(duì)于臨床上的單個(gè)病例需要雙份血清才能確診。

1.1.2 被動(dòng)血凝試驗(yàn)（PHA）。周立橋等[1]運(yùn)用PEG純化的抗原來致敏醛化的綿羊紅細(xì)胞建立PHA試驗(yàn)，檢測(cè)豬和人血清中的JEV抗體，發(fā)現(xiàn)其具有較高的敏感性。陳伯權(quán)[2]用JEV單克隆抗體（McAb14）致敏羊血球，做反向被動(dòng)血凝試驗(yàn)（RPHA）用來檢測(cè)乙腦抗原，發(fā)現(xiàn)其具有較高的特異性。

1.1.3 膠凝集試驗(yàn)（LAT）。賈杏林等[3]研制的LAT檢測(cè)試劑盒與HI的總符合率接近90%，且LAT具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏性高和特異性較好等優(yōu)點(diǎn)，適用于大規(guī)模乙腦抗體的檢測(cè)。

1.1.4 SPA協(xié)同凝集試驗(yàn)（SPA-CoA）。宋大偉等[4]應(yīng)用新型SPA協(xié)同凝集試驗(yàn)（SPA-CoA）檢測(cè)JEV抗體，并與HI進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者的陽(yáng)性符合率和總符合率較高。新型SPA-CoA更為簡(jiǎn)便和實(shí)用，且不需要專門的實(shí)驗(yàn)器材，特別適用于基層的早期現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

1.2 中和試驗(yàn)（NT）

中和試驗(yàn)是國(guó)際公認(rèn)的乙腦病毒血清學(xué)檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)。該方法也是采取雙份血清進(jìn)行診斷，特異性高，但操作復(fù)雜且耗時(shí)，僅用于實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，在臨床中很少應(yīng)用。

1.3 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CT）

補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CT）是診斷乙腦的一種常用方法。一般在發(fā)病早期和恢復(fù)期（病后2～3周以上）各采血1次，并在同1次CT中進(jìn)行測(cè)定。如果恢復(fù)期血清比發(fā)病早期血清的效價(jià)高4倍以上，才能判定為陽(yáng)性。因此CT方法只適用于對(duì)乙腦的確診，常作為回顧性診斷，不宜用于疾病的快速診斷。

1.4 熒光抗體技術(shù)

1.4.1 熒光抗體染色法。許基龍等[5]用冰凍熒光抗體染色的方法檢測(cè)到了組織中的JEV。侯世寬等[6]以辣根過氧化物酶為標(biāo)記物，過碘酸鈉法標(biāo)記兔抗豬IgG制備酶標(biāo)記抗原，經(jīng)Sephadex G-200純化后，用以檢測(cè)和鑒定組織培養(yǎng)系統(tǒng)中的JEV抗原，證明其有較好的特異性和敏感性。

1.4.2 間接免疫熒光（IFA）。李鐘鐸[7]用JEV感染BHK-21細(xì)胞固定后作IFA染色的底物，建立了檢測(cè)乙腦抗體的IFA方法，并與HI及CF法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)微量免疫熒光法最敏感。朱兆奎等[8]用JEV感染的C6/36白蚊伊蚊細(xì)胞制備抗原片和用FITC標(biāo)記兔抗豬IgG抗體建立了IFA方法。臨床試驗(yàn)表明該方法能用于豬乙腦血清流行病學(xué)調(diào)査。王吉等[9]建立的IFA方法靈敏度是LAT試驗(yàn)的8倍。IFA由于其操作繁瑣，血清中的非特異性吸附及熒光顯微鏡等的限制，僅限于實(shí)驗(yàn)室使用。

1.5 斑點(diǎn)金免疫滲濾檢測(cè)法（Dot immunogold filtration assay，DIGFA）

王祥等[10]建立了一種以固相濾膜為載體，以紅色膠體金顆粒標(biāo)記的兔抗豬IgG作為探針，特異性地檢測(cè)JEV抗體的DIGFA法。本法數(shù)分鐘內(nèi)即可用肉眼觀查結(jié)果，適合于乙腦快速診斷和大規(guī)模血清流行病學(xué)調(diào)查，但不能準(zhǔn)確定量和自動(dòng)分析。

1.6 膠體金免疫層析法（Gold immunochromatography assay，GICA）

Li等[11]用膠體金標(biāo)記單克隆抗體2A2使之與JEV的E蛋白結(jié)合，形成的結(jié)合物再與單克隆抗體4D1結(jié)合建立的GICA方法可以檢測(cè)到2.5PFU的JEV，與RT-PCR比較其特異性與靈敏度分別達(dá)到了99.3%和85.7%。田純見等[12]也建立了乙腦抗體的GICA檢測(cè)方法。GICA是一種簡(jiǎn)便、快速、特異、靈敏的檢測(cè)方法，適合于樣品的快速檢測(cè)和基層的推廣使用，缺點(diǎn)是不能準(zhǔn)確定量和自動(dòng)分析。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

1.7.1 間接ELISA。孫圣福[13]分別建立了檢測(cè)JEV全病毒和E蛋白的間接ELISA方法并研制試劑盒，用兩種試劑盒對(duì)97份血清進(jìn)行了同步檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩者符合率為95.8%，均比HI方法陽(yáng)性檢出率高。沈婷等[14]用JEV弱毒疫苗株作為包被抗原建立了間接ELISA方法，其陽(yáng)性檢出率明顯高于LAT方法。賈杏林等[15]、黃少梅[16]、諶劍波等[17]、李曉華等[18]先后應(yīng)用建立的間接ELISA方法對(duì)當(dāng)?shù)夭刹杉难獦舆M(jìn)行了抗體檢測(cè)。Konishi等[19]、吳鵬等[20]先后應(yīng)用重組的NS1蛋白作為包被抗原建立了間接ELISA方法。祖立闖等[21]、鐘澤棟[22]以JEV重組E蛋白為包被抗原建立了間接ELISA方法并組裝試劑盒。張麗穎等[23]、郭銳等[24]先后用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)JEV的E蛋白和ED III蛋白建立了間接EL1SA方法。間接ELISA方法為臨床JEV血清抗體檢測(cè)及其疫苗的免疫效果評(píng)價(jià)提供了技術(shù)手段。馬淑娟等[25]比較我國(guó)3種商品化ELISA試劑盒的診斷效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)目前商品化豬乙腦病毒血清IgG抗體ELISA檢測(cè)試劑盒診斷結(jié)果差異較大，與中和試驗(yàn)相比存在較高的假陰性，質(zhì)量有待提高。

1.7.2 雙抗體夾心ELISA（DS-ELISA）。張寧[26]在對(duì)JEV E蛋白基因克隆和表達(dá)的基礎(chǔ)上建立了雙抗體夾心ELISA法并組裝試劑盒，發(fā)現(xiàn)其敏感性、特異性及可重復(fù)性達(dá)到了實(shí)驗(yàn)要求。張芯銓[27]也研制出雙抗體夾心ELISA試劑盒用于乙腦的檢測(cè)。

1.7.3 Dot-ELISA。Solomon等[28]建 立 了 IgM Dot-ELISA快速診斷JEV的方法。Dot-ELISA方法采用對(duì)蛋白質(zhì)吸附能力極強(qiáng)的硝酸纖維素膜（NC膜）為固相載體，結(jié)果可用肉眼判定，可在包括基層獸醫(yī)防疫單位在內(nèi)的各領(lǐng)域完成對(duì)豬血清抗體的檢測(cè)，更便于在基層推廣應(yīng)用。

1.7.4 IgM抗 體 捕 獲ELISA（Mac-ELISA）。Jacobson等[29]、Shukla等[30]等對(duì)乙腦的IgM抗體捕獲ELISA方法進(jìn)行了研究。Mac-ELISA解決了由于IgM抗體在體內(nèi)含量較少用常規(guī)ELISA檢測(cè)不能獲得滿意結(jié)果的問題，已較普遍地應(yīng)用于乙腦的早期診斷。

1.7.5 抗原捕獲ELISA（AC-ELISA）。王曉磊等[31]以JEV prM-E蛋白特異性單克隆抗體（McAb）作為捕獲抗體和檢測(cè)抗體建立了抗原捕獲ELISA方法，為JE亞單位疫苗的研制與生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

2 病原學(xué)檢測(cè)方法

2.1 病毒的分離與鑒定

病原的分離與鑒定是豬乙型腦炎檢測(cè)最為直接、經(jīng)典的方法。無菌采取可疑的病料，如流產(chǎn)和死產(chǎn)胎兒的腦、肺、肝、睪丸和胎盤等，接種到乳鼠腦組織或細(xì)胞（BHK-21、C6/36、Vero等）進(jìn)行分離。根據(jù)乳鼠出現(xiàn)的癥狀和細(xì)胞的病變（病毒在BHK-21、Vero細(xì)胞上產(chǎn)生的病變是圓縮、脫落及破裂，在C6/36細(xì)胞上可觀察到細(xì)胞融合形成的空泡，在瓊脂糖或甲基纖維素覆蓋下能形成蝕斑）進(jìn)行判定。獲得病毒后，用JEV標(biāo)準(zhǔn)毒株和標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清或分子生物學(xué)等方法進(jìn)行鑒定。病毒分離與鑒定結(jié)果準(zhǔn)確，但因其操作繁瑣，試驗(yàn)條件要求高，耗時(shí)且影響因素多，不能實(shí)現(xiàn)乙腦的快速檢測(cè)。

2.2 分子生物學(xué)方法

2.2.1 RT-PCR。許多學(xué)者用乙腦病毒的E、C、NS1、NS3等特異基因設(shè)計(jì)RT-PCR引物，對(duì)乙腦做快速檢測(cè)，均得到很好的檢測(cè)效果。崔奕杰等[32]、李茂寧等[33]、王偉杰[34]、李天芝等[35]根據(jù)E基因設(shè)計(jì)引物；孫靜等[36]根據(jù)NS3基因，孫圣福[37]、車勇良等[38]根據(jù)NS1基因，高正琴等[39]根據(jù)C基因分別設(shè)計(jì)引物，建立的RT-PCR方法最低可檢出10 pg的DNA。Swami等[40]進(jìn)行了多重RT-PCR與ELISA的比較試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多重RT-PCR比ELISA更適合應(yīng)用于JEV的早期檢測(cè)。蔡緒禹等[41]根據(jù)豬乙腦病毒等5種人獸共患腦炎病毒的基因序列，建立了可同時(shí)檢測(cè)5種病毒的多重RT-PCR方法。何玢等[46]建立了與乙腦病毒相關(guān)的8種蟲媒病毒的多重RT-PCR檢測(cè)方法并應(yīng)用于臨床檢測(cè)。

2.2.2 熒光定量RT-PCR。Jeong等[42]在JEV的3′端非編碼區(qū)用熒光染料SYBR Green I構(gòu)建了實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR來檢測(cè)乙腦病毒，靈敏度可達(dá)15 TCID50。劉衛(wèi)濱等[43]根據(jù)JEV NS5基因、黃福新等[44]根據(jù)NS3基因、霍紅等[45]根據(jù)E基因分別設(shè)計(jì)引物與探針，建立了TaqMan熒光定量RTPCR并成功應(yīng)用于豬血清樣品的檢測(cè)。該方法是常規(guī)PCR靈敏度的100倍。

2.2.3 RT-LAMP。逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RTLAMP）技術(shù)是一種快速、敏感、可靠、成本低廉的方法。盧冰霞等[46]、李海洋等[47]先后根據(jù)JEV E基因設(shè)計(jì)4條特異性LAMP引物，建立了RT-LAMP方法，方便了臨床上對(duì)JEV的大批量快速篩查。田純見等[48]根據(jù)JEV NS3基因、孫圣福等[49]根據(jù)M基因設(shè)計(jì)引物，也建立了RTLAMP方法。RT-LAMP方法操作簡(jiǎn)便、時(shí)間短，對(duì)儀器設(shè)備要求較低，肉眼下即可觀察結(jié)果，特別適合基層單位和野外的使用。

2.2.4 PCR-ELISA微板雜交法。PCR-ELISA將基因擴(kuò)增、核酸雜交和酶聯(lián)顯色3種診斷技術(shù)融為一體，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。任瑞文等[50]分別設(shè)計(jì)了黃熱及乙腦病毒的特異性捕獲探針及信號(hào)探針，建立了快速檢測(cè)黃熱病毒及乙腦病毒的PCR-ELISA微板雜交法。

2.2.5 基因芯片技術(shù)。張煥容等[51]構(gòu)建了偽狂犬病病毒（PRV）、豬細(xì)小病毒（PPV）和乙腦病毒檢測(cè)基因芯片。該基因芯片技術(shù)可對(duì)PRV、PPV和JEV進(jìn)行同步檢測(cè)和鑒別診斷。張仙[52]選取PRRSV的Y11基因、CSFV的PS8基因和JEV的C基因設(shè)計(jì)探針，進(jìn)行了PRRSV-CSFV-JEV直觀可視化基因芯片的構(gòu)建，對(duì)四川102份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與常規(guī)RT-PCR方法的符合率高于97.5%。

3 小結(jié)

豬乙型腦炎是重要的人獸共患病之一，威脅人類的健康和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。提高乙腦病毒檢測(cè)的質(zhì)量和效率，需要根據(jù)病程的發(fā)展建立完善的檢測(cè)體系和策略，并結(jié)合分離培養(yǎng)、血清學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)，科學(xué)選擇合理的方法進(jìn)行檢測(cè)。隨著微生物基因組學(xué)、現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)不斷完善，新技術(shù)及儀器的不斷開發(fā)和使用，必將實(shí)現(xiàn)乙腦病毒的快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異、自動(dòng)化檢測(cè)，達(dá)到疾病早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防的目的，為豬乙型腦炎的防治提供時(shí)間和技術(shù)保障，也為畜牧業(yè)生產(chǎn)減少經(jīng)濟(jì)損失，獲得更大的經(jīng)濟(jì)效益。

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（責(zé)任編輯：杜憲）

Research Progress on the Detection Methods of the Japanese Encephalitis Virus

Zhuang Jinqiu，Mei Jianguo，Zhang Ying，Mo Ling，Li Feng，Shen Zhiqiang
（Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy，Binzhou，Shandong 256600）

Japanese encephalitis（JE）has caused serious damage to human health and great economic losses to the swine industry in the world. The research progress of the latest laboratory detection methods of Japanese encephalitis virus was summarized，in order to provide reference for the prevention and control of this disease.

Japanese encephalitis；Japanese encephalitis virus；detection method；research progress

855.9+9

B

1005-944X（2017）11-0060-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.11.017

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2015GSF121027）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-08-17）