大皰性類天皰瘡患者皰液中趨化因子受體5和可誘導共刺激分子的檢測

姜蔚蔚 朱英華 楊敏 岳宏元 王紅梅 楊海瓊 焦陽116021大連醫(yī)科大學（姜蔚蔚、焦陽）；大連市皮膚病醫(yī)院皮膚科（朱英華、楊敏、岳宏元、王紅梅、楊海瓊）

·研究報道·

大皰性類天皰瘡患者皰液中趨化因子受體5和可誘導共刺激分子的檢測

姜蔚蔚 朱英華 楊敏 岳宏元 王紅梅 楊海瓊 焦陽
116021大連醫(yī)科大學（姜蔚蔚、焦陽）；大連市皮膚病醫(yī)院皮膚科（朱英華、楊敏、岳宏元、王紅梅、楊海瓊）

目的檢測C?X?C趨化因子受體5（CXCR5）和可誘導共刺激分子（ICOS）在大皰性類天皰瘡（BP）患者皰液中的水平，探討其在BP發(fā)病機制中的意義。方法收集15例BP患者皰液為實驗組，15例Ⅱ度燒傷患者皰液為對照組，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）方法分別檢測CXCR5及ICOS在兩組皰液中的水平。結(jié)果實驗組及對照組皰液中CXCR5水平分別為（219±145.31）、（147±23.83）ng/L，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.577，P＜0.05），但皰液中ICOS水平差異無統(tǒng)計學意義［（30.18±14.86）比（21.43±5.32）ng/L，t=1.628，P＞0.05］。結(jié)論CXCR5的表達可能與BP發(fā)病有一定關系，而ICOS與BP發(fā)病的關系尚需進一步研究。

類天皰瘡，大皰性；受體，CXCR5；可誘導協(xié)同刺激分子；皰液

既往研究證實，輔助性T細胞、調(diào)節(jié)性T細胞等均參與大皰性類天皰瘡（BP）的發(fā)病過程［1?6］。但自2000年報道了表型為CXCR5+CD40L+ICOS+的T細胞亞群即濾泡輔助性T細胞（follicular helper T cells，Tfh）［7］以來，其輔助B細胞產(chǎn)生自身抗體、發(fā)揮免疫效應的作用在眾多自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）［8］、干燥綜合征［9］等中得到證實，李秋菊［10］和楊敏［11］等分別對Tfh及其相關細胞因子在BP發(fā)病機制中的作用進行研究，認為Tfh可能參與BP的發(fā)病。我們用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測BP患者皰液中趨化因子受體5（CXCR5）和可誘導協(xié)同刺激分子（ICOS）的水平，以期進一步探討Tfh細胞在BP發(fā)病機制中的作用。

一、對象與方法

1.病例與標本：2014年3月至2015年9月大連市皮膚病醫(yī)院門診或病房初次就診，結(jié)合臨床表現(xiàn)、組織病理及免疫熒光確診［12］的患者15例，其中男10例，女5例，年齡（70.07±6.71）歲，皰液標本均取自患者新發(fā)未感染水皰。對照組為Ⅱ度燙傷患者15例，男10例，女5例，年齡（66.93±6.50）歲，取其水皰皰液。將皰液標本離心（離心半徑10 cm，3 000 r/min）5 min后，取上清液，保存于-70℃冰箱中。實驗組與對照組之間年齡、性別等資料具有可比性。本實驗已通過大連市皮膚病醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

2.試劑：人CXCR5、ICOS ELISA試劑盒、考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒，均產(chǎn)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

3.方法：雙抗體夾心ELISA法分別檢測實驗組和對照組皰液中CXCR5和ICOS的水平，嚴格按照說明書步驟執(zhí)行。在450 nm處測吸光度A值，通過繪制標準曲線計算標本中CXCR5、ICOS濃度?？捡R斯亮藍法分別對兩組皰液中的總蛋白水平進行測定，于比色杯中加入990 μl考馬斯亮藍G250和10 μl樣品，放于37 ℃、120 r/min（半徑16 mm）空氣振蕩10 min，然后于紫外可見光分光光度計（Ultrospec 2100 Pro uv/visible Spectrophotometer，美國通用電氣公司，General Electric Company，美國）中595 nm波長處進行比色，得到吸光度A值，根據(jù)標準曲線計算蛋白濃度。

4.統(tǒng)計學分析：用SPSS16.0軟件包進行兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

二、結(jié)果

1.CXCR5在BP患者皰液中的水平：實驗組CXCR5的平均水平為（219±145.31）ng/L，對照組CXCR5的平均水平為（147±23.83）ng/L，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.577，P＜0.05）。

2.ICOS在BP患者皰液中的水平：BP患者皰液中ICOS的水平為（30.18±14.86）ng/L，對照組為（21.43±5.32）ng/L，兩組間差異無統(tǒng)計學意義（t=1.628，P＞0.05）。

3.皰液中總蛋白水平：實驗組中總蛋白水平為（1.09±0.07）×106ng/L，對照組為（9.53±0.84）×105ng/L，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.015，P＞0.05）。

三、討論

Tfh是一種抗原特異性介導初始B細胞及記憶B細胞活化的特殊CD4+T細胞，它存在于次級淋巴器官的B細胞濾泡內(nèi)［13］。CXCR5是Tfh產(chǎn)生和發(fā)展的主要表面標志，也是最容易測量的標記物，濾泡的重新定位是Tfh發(fā)展和發(fā)揮作用中重要的一步［14］。T細胞的活化及抗原的持續(xù)暴露引起CXCR5的表達［8］，所以檢測到CXCR5的表達可在一定程度上提示T細胞活化、分化成Tfh細胞，或者抗原持續(xù)暴露。ICOS是CD28家族的成員，在Tfh表面高表達，它與抗原提呈細胞表面的配體ICOSL結(jié)合并相互作用，對Tfh細胞的產(chǎn)生、維持及發(fā)揮作用都重要［15］。

我們的實驗顯示，CXCR5在BP皰液中的水平顯著升高（P＜0.05），提示CXCR5可能與BP發(fā)病有一定關系；而ICOS在BP皰液中的水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，該結(jié)果與我們預想的不一致，分析可能原因如下：一種是ICOS同時存在于正常人的體內(nèi)及BP患者的皰液中，此細胞因子可能和致病相關，也可能只是上游細胞間反應激發(fā)的下游產(chǎn)物或伴隨因子，但它們是一種不穩(wěn)定的小分子蛋白，會隨著時間的推移而解構(gòu)或丟失；另一種可能性是我們的樣本量少，不能真實反映ICOS在正常人體液及BP患者皰液中的差異，ICOS與BP發(fā)病相關性需擴大樣本進行探討。另外，相對于以往報道的BP患者皰液中多種細胞因子［16］，所測得的ICOS和CXCR5含量相對較低，在皰液中進行此類成分的檢查，較為困難，提示在今后的研究中應收集較多的皰液濃縮后再進行實驗，可能會提高檢出率。

［1］Giomi B,Caproni M,Calzolari A,et al.Th1,Th2 and Th3 cytokines in the pathogenesis of bullous pemphigoid［J］.J Dermatol Sci,2002,30（2）:116?128.

［2］耿士玲,單士軍,吳劍,等.大皰性類天皰瘡皮損中Th1/Th2趨化因子及其受體的表達［J］.中國免疫學雜志,2010,26（3）:270?272.

［3］Le JS,Plée J,Vallerand D,et al.Innate immune cell?produced IL?17 sustains inflammation in bullous pemphigoid［J］.J Invest Dermatol,2014,134（12）:2908?2917.DOI:10.1038/jid.2014.263.

［4］Arakawa M,Dainichi T,Ishii N,et al.Lesional Th17 cells and regulatory T cells in bullous pemphigoid［J］.Exp Dermatol,2011,20（12）:1022?1024.DOI:10.1111/j.1600?0625.2011.01378.x.

［5］Terras S,Gambichler T,Moritz RK,et al.Immunohistochemical analysis of FOXP3+regulatory T cells in healthy human skin and autoimmune dermatoses［J］.Int J Dermatol,2014,53（3）:294 ?299.DOI:10.1111/j.1365?4632.2012.05808.x.

［6］Antiga E,Quaglino P,Volpi W,et al.Regulatory T cells in skin lesions and blood of patients with bullous pemphigoid［J］.J Eur Acad Dermatol Venereol,2014,28（2）:222?230.DOI:10.1111/jdv.12091.

［7］金伯泉.T?B細胞協(xié)作研究的重大突破——濾泡輔助性T細胞的發(fā)現(xiàn),一個新的CD4+效應T細胞亞群［J］.細胞與分子免疫學雜志,2009,25（1）:1?5.DOI:10.3321/j.issn.1007?8738.2009.01.001.

［8］Simpson N,Gatenby PA,Wilson A,et al.Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype that identifies a subset of severe systemic lupus erythematosus［J］.Arthritis Rheum,2010,62（1）:234 ?244.DOI:10.1002/art.25032.

［9］Maehara T,Moriyama M,Hayashida JN,et al.Selective locali?zation of T helper subsets in labial salivary glands from primary Sj?gren′s syndrome patients［J］.Clin Exp Immunol,2012,169（2）:89?99.DOI:10.1111/j.1365?2249.2012.04606.x.

［10］李秋菊.濾泡輔助性T細胞（Tfh）與自身免疫性皰病的相關性研究［D］.西安:第四軍醫(yī)大學,2012.

［11］楊敏,朱英華,崔紅艷,等.大皰性類天皰瘡患者皮損中CXCR5的表達及意義［J］.中華皮膚科雜志,2014,47（7）:506?508.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2014.07.016.

［12］趙辨.中國臨床皮膚病學［M］.南京:江蘇科學技術(shù)出版社,2010:843?844.

［13］Papp G,Szabó K,Szekanecz Z,et al.Follicular helper T cells in autoimmune diseases［J］.Rheumatology（Oxford）,2014,53（7）:1159?1160.DOI:10.1093/rheumatology/ket434.

［14］Qi H,Chen X,Chu C,et al.Follicular T?helper cells:controlled localization and cellular interactions［J］.Immunol Cell Biol,2014,92（1）:28?33.DOI:10.1038/icb.2013.59.

［15］Vinuesa CG,Tangye SG,Moser B,et al.Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity［J］.Nat Rev Immunol,2005,5（11）:853?865.DOI:10.1038/nri1714.

［16］Bhol KC,Rojas AI,Khan IU,et al.Presence of interleukin 10 in the serum and blister fluid of patients with pemphigus vulgaris and pemphigoid［J］.Cytokine,2000,12（7）:1076 ?1083.DOI:10.1006/cyto.1999.0642.

Detection of C?X?C chemokine receptor type 5 and inducible costimulator in blister fluid of patients with bullous pemphigoid

Jiang Weiwei,Zhu Yinghua,Yang Min,Yue Hongyuan,Wang Hongmei,Yang Haiqiong,Jiao Yang
Dalian Medical University,Dalian 116021,China（Jiang WW,Jiao Y）;Department of Dermatology,Dalian Dermatosis Hospital,Dalian 116021,China（Zhu YH,Yang M,Yue HY,Wang HM,Yang HQ）

Zhu Yinghua,Email:zyh?office@163.com

ObjectiveTo detect levels of C?X?C chemokine receptor type 5（CXCR5）and inducible costimulator（ICOS）in blister fluid of patients with bullous pemphigoid（BP）,and to explore their significance in the pathogenesis of BP.MethodsBlister fluid samples were collected from 15 patients with BP（experimental group）and 15 patients with second?degree burns（control group）.Enzyme?linked immunosorbent assay（ELISA）was performed to detect the levels of CXCR5 and ICOS in the 2 groups.ResultsThe level of CXCR5 was significantly higher in the experimental group than in the control group（219±145.31vs.147±23.83 ng/L,t=4.577,P＜0.05）,while no significant difference in the ICOS level was observed between the 2 groups（30.18±14.86vs.21.43±5.32 ng/L,t=1.628,P＞ 0.05）.ConclusionThe expression of CXCR5 may be associated with the occurrence of BP,but further researches are needed to determine the relationship between ICOS and the occurrence of BP.

Pemphigoid,bullous;Receptors,CXCR5;Inducible costimulator;Blister fluid

朱英華，Email：zyh?office@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.01.011

2016?03?17）

（本文編輯：尚淑賢）