瘧疾的實時熒光PCR快速檢測方法探討

張國斌

（沈陽市疾病預防控制中心，遼寧 沈陽 110031）

瘧疾的實時熒光PCR快速檢測方法探討

張國斌

（沈陽市疾病預防控制中心，遼寧 沈陽 110031）

目的 探討瘧疾的實時熒光PCR快速檢測方法。方法 選擇本市國際旅行衛(wèi)生保健中心提供的瘧疾鏡檢陽性血樣20份，另選擇健康者（瘧疾鏡檢陰性）血樣20份作為待測血樣。本研究設計了瘧疾病原體實時熒光PCR快速檢測的引物和探針，總結了快速檢測方法，瘧疾鏡檢陽性/陰性血樣均各分為4次檢測完畢，統(tǒng)計各份血樣檢測結果和每次檢測時間，計算平均用時和瘧疾鏡檢與實時熒光PCR檢測符合率。結果 瘧疾鏡檢陽性血樣20份，檢測4次，平均用時（19.15±1.34）min，瘧疾鏡檢陰性血樣平均用時為（19.52±1.49）min，40份血樣熒光PCR檢測平均用時（19.34±1.65）min。在熒光PCR檢測與瘧疾鏡檢符合率方面，陽性血樣（100%）和陰性血樣（90.00%）比較，無顯著差異P＞0.05，認為無統(tǒng)計學意義。40份待測血樣熒光PCR檢測和瘧疾鏡檢符合率為95.00%（38/40）。結論 本研究瘧疾病原體實時熒光PCR快速檢測準確性高，陽性檢出高，檢測時間段，用于瘧疾快速檢驗可行性較強，不易發(fā)生漏檢情況。

瘧疾；實時熒光；PCR；快速檢測；巢式PCR

瘧疾是我國流行病防治的重點，檢測診斷多依靠瘧原蟲形態(tài)檢查、抗體血清學檢查以及瘧原蟲體抗原檢測等方法，鏡檢是較為可靠的瘧原蟲檢測方法，但存在各種限制因素，假陰性率較高，較容易出現(xiàn)漏診情況，故需要探索一套更為靈敏、快捷的檢測方法[1]。為此，為此，本研究設計了瘧疾病原體實時熒光 PCR快速檢測的引物和探針，總結了一套快速檢測方法，選擇本市國際旅行衛(wèi)生保健中心提供的瘧疾鏡檢陽性血樣20份，另選擇健康者（瘧疾鏡檢陰性）血樣20份作為待測血樣，統(tǒng)計各份血樣檢測結果，對比分析了瘧疾鏡檢與實時熒光 PCR 檢測符合率，報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料：選擇本市國際旅行衛(wèi)生保健中心提供的瘧疾鏡檢陽性血樣20份，另選擇健康者（瘧疾鏡檢陰性）血樣20份作為待測血樣。40份血樣均為靜脈血，采用真空采血管（2%EDTA-Na2抗疑）采血，在本實驗室按要求（20 ℃）保存。

1.2 試劑及DNA提?。罕締挝徊捎肣iagen公司全血DNA提取試劑盒和熒光PCR試劑。按QIAamp DNA Blood Extraction Minikit提取瘧原蟲DNA并低溫保存。

1.3 引物設計合成：惡性瘧、間日瘧、三日瘧和卵形瘧的SSU rRNA基因的引物和探針，由上海生工生物工程公司合成，包括實時熒光PCR檢測的引物、探針。各引物擴增參數(shù)為：Plas-FP 、Plas-RP和Plas-Pro擴增長度73 bp；rPLUout-FP和rPLUout-RP擴增長度1815 bp；rPLUin-FP和rPLUin-RP擴增長度240 bp。使用TaqMan體系配置行熒光PCR檢測，58 ℃收集熒光，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，隨后進行擴增產(chǎn)物電泳分析，凝膠成像系統(tǒng)結果拍照并分析。

1.4 研究方法：瘧疾鏡檢陽性血樣20份，每次檢測5份，共分為4次檢測完畢，統(tǒng)計各份血樣檢測結果和每次檢測時間，計算平均用時。瘧疾鏡檢陰性血樣處理方法同上。統(tǒng)計瘧疾鏡檢與實時熒光PCR檢測符合率。

1.5 統(tǒng)計學方法：采用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件分析研究數(shù)據(jù)，計量資料采用t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05認為差異顯著，有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 瘧疾實時熒光PCR檢測時間：瘧疾鏡檢陽性血樣20份，檢測4次，用時為18～20 min，平均 （19.15±1.34）min。瘧疾鏡檢陰性血樣20份，檢測4次，用時為18～21 min，平均 （19.52±1.49）min。瘧疾鏡檢陰性血樣和瘧疾鏡檢陽性血樣熒光 PCR檢測時間無明顯差異P＞0.05，40份血樣熒光PCR檢測平均用時（19.34±1.65）min，約為20 min。

2.2 瘧疾實時熒光PCR檢測結果與鏡檢比較：瘧疾鏡檢陽性血樣20份中，熒光PCR檢測陽性20份，熒光PCR檢測和瘧疾鏡檢符合率為100%（20/20）。瘧疾鏡檢陰性血樣20份中，熒光PCR檢測陰性為18份，檢出陽性2份，熒光PCR檢測和瘧疾鏡檢符合率為90.00%（18/20）。在熒光PCR檢測與瘧疾鏡檢符合率方面，陽性血樣（100%）和陰性血樣（90.00%）比較，無顯著差異P＞0.05，認為無統(tǒng)計學意義。40份待測血樣熒光PCR檢測和瘧疾鏡檢符合率為95.00%（38/40）。

3 討 論

我國并非瘧疾疫區(qū)國家，但是近年來我國勞動力輸出增多，較多瘧疾疫區(qū)生活人員往來于我國境內，因而必須有效控制瘧疾的傳入。國境口岸等單位是負責瘧疾檢測工作的主要部門，需要應對各類瘧疾檢測，但傳統(tǒng)瘧原蟲形態(tài)檢查、抗體血清學檢查以及瘧原蟲體抗原檢測等方法，存在耗時長或一次檢測數(shù)量有限等問題，影響了瘧疾病原體檢測效率。為此，應更為快捷、準確的瘧疾檢測系統(tǒng)[2]。

近年來，基因擴增技術趨于成熟，因而應探索該方法在瘧原蟲基因檢測方面的優(yōu)勢性。為此，本次研究基于各類瘧疾病原體的SSU rRNA基因序列，設計了熒光PCR快速檢測的引物和探針，形成了一套通用型實時熒光PCR快速檢測方法。實時熒光PCR快速檢測時間較短，本次研究40份血樣熒光PCR檢測平均用時（19.34±1.65）min，約為20 min，可知其檢測速度較快，檢測效率明顯提升。當前，國內對實時熒光PCR快速檢測逐漸增多，但是對于快速檢測的準確性仍存在一定的爭議，尚無可靠論據(jù)[3]。本次研究對比分析了瘧疾鏡檢陽性血樣與陰性血樣的熒光PCR快速檢測結果，發(fā)現(xiàn)鏡檢陽性血樣熒光PCR檢測和瘧疾鏡檢符合率達到了100%（20/20），而瘧疾鏡檢陰性血樣20份中，熒光PCR檢測陰性為18份，熒光PCR檢測和瘧疾鏡檢符合率為90.00%，瘧疾鏡檢陽性血樣與陰性血樣的熒光PCR快速檢測結果無顯著差異，40份待測血樣熒光PCR檢測和瘧疾鏡檢符合率高達95.00%（38/40），可知熒光PCR快速檢測結果較為準確、可靠，提示該快速檢測方法實驗室應用價值較高。但是本次研究在對比陰/陽血樣熒光PCR快速檢測結果中也發(fā)現(xiàn)，雖然鏡檢陽性血樣熒光PCR檢測和瘧疾鏡檢符合率較高，但是瘧疾鏡檢陰性血樣20份中，檢出陽性2份，存在一定的假陽性概率，而無假陰性血樣，提示在熒光PCR快速檢測中應對陽性病例，再次實施瘧疾鏡檢，以排除假陽性病例，保證檢測結果準確性。當前，熒光PCR快速檢測技術快速發(fā)展，多數(shù)通用熒光PCR快速檢測設備已經(jīng)可以完成1次90份以上的檢測量，基本可以滿足國境口岸等單位大規(guī)模檢測的需求，對于我國瘧疾防控工作具有重要意義。

綜上所述，本研究瘧疾病原體實時熒光PCR快速檢測準確性高，陽性檢出高，檢測時間段，用于瘧疾快速檢驗可行性較強，不易發(fā)生漏檢情況。

[1] 營雅茹,李衛(wèi)東,張?zhí)?等.快速檢測試劑條、鏡檢和PCR在瘧疾診斷中的應用研究[J].中華疾病控制雜志,2014,10(2):163-165.

[2] 祁軍,于智睿,黃吉城,等.交叉引物等溫擴增技術在惡性瘧疾快速檢測中的應用[J].中國媒介生物學及控制雜志,2013,8(3):204-207.

[3] 孫亞維,魯峰,張劼楠.瘧疾Dia Med Opti MAL-IT快速檢測技術的臨床應用[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2012,5(7):1604-1605.

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1671-8194（2017）07-0017-02