豬繁殖與呼吸綜合征病毒類NADC30毒株的新近流行

周 磊丁玉平

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；2廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東新興 527400）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒類NADC30毒株的新近流行

周 磊1*丁玉平2

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；2廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東新興 527400）

豬繁殖與呼吸綜合征是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬生產(chǎn)的病毒性傳染病。自20世紀(jì)90年代中期在我國(guó)發(fā)生和流行以來(lái)，已經(jīng)20余載。據(jù)田間流行優(yōu)勢(shì)毒株的不同，可大致分為三個(gè)階段：經(jīng)典毒株流行階段 （1995-2006年）、高致病性變異株流行階段 （2006-2013年）和新近的類NADC30毒株流行階段 （2013年至今）。2013-2014年間與美國(guó)分離株NADC30親緣性較高的一類PRRSV毒株開(kāi)始在我國(guó)暴發(fā)流行，其具有與NADC30和MN184等譜系1（lineage 1）毒株相同的nsp2編碼區(qū)缺失模式。致病性分析及疫苗保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明，其致病性介于高致病性毒株與經(jīng)典株之間，目前商用疫苗對(duì)其保護(hù)效果不佳。且類NADC30毒株易與其他PRRSV毒株發(fā)生重組，產(chǎn)生新的變異株。類NADC30毒株的廣泛流行，以及相關(guān)重組毒株的疊現(xiàn)，進(jìn)一步增加了PRRS疫病防控的難度。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒 （PRRSV）；類NADC30（NADC30-like）；分子流行病學(xué)；致病性與免疫保護(hù)；重組

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是以引起母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎等繁殖障礙以及各日齡豬只呼吸道疾病為特征的病毒性傳染病[1]。自20世紀(jì)80年代末，該病首次在美國(guó)[2]和歐洲[3,4]相繼暴發(fā)以來(lái)，出現(xiàn)并流行已近30年，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

病原豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）屬于動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬成員，為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組不分節(jié)段[5]。根據(jù)該病毒抗原性和基因組差異，可分為以LV毒株為代表的歐洲型（基因1型）和以VR-2332毒株為代表的北美型（基因2型）[6]。Shi等[7]基于全球PRRSV ORF5序列的遺傳演化分析，可將基因2型毒株分為9個(gè)譜系(lineage)，該研究其后成為同一基因型內(nèi)毒株分類的重要標(biāo)準(zhǔn)。PRRSV致病性以及免疫原性在兩種基因型間存在較大差異，同時(shí)，即使在同一基因型內(nèi)，也存在廣泛的毒株多樣性。其基因組的持續(xù)變異以及異源毒株間交叉保護(hù)力較差的特性，是導(dǎo)致其廣泛流行、難以防控的重要原因。

1 我國(guó)不同流行階段的毒株特征

我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)于1991年首次報(bào)道該病的暴發(fā)，隨后大陸地區(qū)于20世紀(jì)90年代中期發(fā)生和流行該病，并在短時(shí)間內(nèi)便廣泛傳播至全國(guó)各地[8]。自PRRS首次流行至今，基因2型毒株一直是我國(guó)的主要流行毒株，基因1型毒株僅有零星報(bào)道，且分離株致病性不高，尚未顯示太大的臨床危害[9,10]。根據(jù)田間自然分離株的基因組及致病性特征，可人為地將我國(guó)PRRS的流行大致分為三個(gè)階段。

第一個(gè)階段為經(jīng)典毒株流行階段。1996年郭寶清等[8]在北京某發(fā)病豬場(chǎng)的流產(chǎn)胎兒內(nèi)分離出第一株基因2型的國(guó)內(nèi)流行株CH-1a，該毒株與美國(guó)最早的分離株VR-2332在基因組序列上差異較大，目前還沒(méi)有確切的證據(jù)表明CH-1a是來(lái)源于北美還是我國(guó)本土演化而來(lái)的毒株。1997年楊漢春等[11]分離到一株與VR-2332毒株高度同源的毒株BJ-4，序列分析溯源表明該毒株來(lái)源于北美的生豬引種或豬產(chǎn)品貿(mào)易引入我國(guó)。2004年Gao等[12]報(bào)道了兩株特征性分離株HB-1(sh)/2002以及HB-2(sh)/2002。前者后來(lái)證明是CH-1a向高致病毒株演化過(guò)程中的中間毒株，而后者則是第一個(gè)報(bào)道的nsp2編碼區(qū)內(nèi)含有12個(gè)氨基酸缺失的自然缺失株。該階段PRRS在臨床的發(fā)病多以母豬流產(chǎn)為主，兼有各日齡豬只的呼吸道癥狀，但對(duì)豬只特別是成年豬的致死性鮮有報(bào)道。

第二個(gè)階段為高致病性變異株的流行階段。2006年夏，以高熱、急性死亡、高發(fā)病率和高死亡率以及妊娠母豬的嚴(yán)重繁殖障礙為特征的嚴(yán)重型PRRS（Atypical PRRS）在我國(guó)暴發(fā)和流行，造成大批豬只死亡，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了前所未有的沖擊[13,14]。研究表明，該病的病原是高致病性PRRSV（highly pathogenic PRRSV,HP-PRRSV），其nsp2編碼區(qū)內(nèi)30個(gè)氨基酸（481aa，531—561aa）的缺失模式是其重要分子標(biāo)志。隨后該毒株席卷全國(guó)，并傳至周邊東南亞國(guó)家，迅速成為田間的優(yōu)勢(shì)流行株。通過(guò)對(duì)之前不同年代的分離株進(jìn)行遺傳演化分析發(fā)現(xiàn)，HP-PRRSV是由我國(guó)早前毒株經(jīng)歷基因組的變異逐漸演化而來(lái)的[15]。隨著致弱活疫苗的廣泛和大量使用，一方面在豬群中形成較強(qiáng)的免疫壓力；另一方面，疫苗株來(lái)源的活病毒在田間仍可循環(huán)和傳播，二者共同導(dǎo)致了PRRSV毒株變異演化速率的加快和毒株多樣性的增加，表現(xiàn)為具有不同插入、缺失、突變和重組特性的新毒株的頻繁出現(xiàn)。雖然隨著豬群免疫水平的增加以及宿主的篩選，HP-PRRSV毒株在流行過(guò)程中致病性逐漸降低，由HP-PRRSV感染引發(fā)的急性死亡案例逐漸減少（但仍有零星發(fā)生），更多的是HP-PRRSV造成的妊娠母豬繁殖障礙，豬群免疫抑制，繼發(fā)感染難以控制，從而導(dǎo)致的生產(chǎn)損失。

第三個(gè)階段為類NADC30毒株的新近流行。2014年以來(lái)，國(guó)內(nèi)多個(gè)實(shí)驗(yàn)室相繼報(bào)道從臨床母豬流產(chǎn)或仔豬呼吸道病發(fā)病病例中分離到屬于譜系1（lineage 1）的新型毒株，該類毒株與美國(guó)的NADC30毒株高度同源，且有相同的nsp2編碼區(qū)的缺失模式，因此命名為類 NADC30（NADC30-like）毒株[16-25]。類 NADC30感染豬場(chǎng)以母豬中后期流產(chǎn)等繁殖障礙為特征，發(fā)病母豬群的流產(chǎn)率可達(dá)30%～40%左右。哺乳仔豬、保育豬和生長(zhǎng)育肥豬以呼吸道疾病為主，豬細(xì)菌性繼發(fā)感染和死淘率增高。且該毒株可在豬場(chǎng)持續(xù)存在很長(zhǎng)時(shí)間，造成種豬群和生長(zhǎng)豬群生產(chǎn)成績(jī)極不穩(wěn)定。

以上三個(gè)階段僅以優(yōu)勢(shì)毒株和流行趨勢(shì)劃分，并無(wú)嚴(yán)格時(shí)間界限，各類毒株的流行情況均有重疊，并有單個(gè)豬場(chǎng)多種毒株共感染的情況存在，因此增加了毒株重組的概率以及PRRS防控的復(fù)雜性。

2 類NADC30毒株分子特征與毒株溯源

本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)2014年8月期間分離的類NADC30代表性毒株CHsx1401進(jìn)行全基因組序列測(cè)定和分析發(fā)現(xiàn)，在不統(tǒng)計(jì)Poly（A）的情況下，該毒株基因組全長(zhǎng)15 020 nt，與NADC30一致，且含有其nsp2編碼區(qū)內(nèi)標(biāo)志性片段缺失，即與基因2型原型株VR-2332相比，其nsp2編碼區(qū)在第323—433位，第481位和第533—551位共計(jì)缺失131個(gè)氨基酸，該缺失方式與同屬 lineage 1的MN184A、MN184B和MN184C一致[26]。

全基因組核苷酸同源性分析表明，CHsx1401與NADC30的親緣性最高，核苷酸同源性為95.7%；與NADC30同一譜系的美國(guó)株 MN184A、MN184B、MN184C的同源性分別為87.1%、87.4%、87.3%；與VR-2332株的同源性為85.8%；與國(guó)內(nèi)高致病性毒株親緣性最低，與JXwn06的同源性僅為83.8%。在基于全基因組核苷酸序列繪制的進(jìn)化樹(shù)中，新分離的類NADC30毒株與北美的 lineage 1毒株 NADC30、MN184A、MN184B和MN184C同屬一個(gè)獨(dú)立分支。該結(jié)果證實(shí)了類NADC30毒株應(yīng)該是由美國(guó)傳入我國(guó)的外來(lái)毒株。

回顧性分析發(fā)現(xiàn)，早于2011年5月本實(shí)驗(yàn)室就從山西某豬場(chǎng)的PRRSV陽(yáng)性病料中擴(kuò)增出與MN184A同屬一個(gè)譜系的ORF5基因。2013年，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)王川慶老師團(tuán)隊(duì)分離到兩株類NADC30毒株HENAN-XINX和HENAN-HEB，全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，與CHsx1401同源性分別為93.0%和93.2%，這兩個(gè)分離株雖與NADC30株的同源性最高，但跟NADC30的親緣性稍微遠(yuǎn)于CHsx1401，說(shuō)明其在河南省的出現(xiàn)應(yīng)該早于2013年，從美國(guó)傳到中國(guó)后已經(jīng)在國(guó)內(nèi)豬群中低水平流行了一段時(shí)間，發(fā)生了變異。

3 類NADC30毒株的致病性及當(dāng)前疫苗對(duì)其保護(hù)性

為了探明類NADC30毒株的致病性，本實(shí)驗(yàn)室參照HP-PRRSV致病性的評(píng)價(jià)體系，用42日齡SPF仔豬系統(tǒng)測(cè)定了代表性毒株CHsx1401的致病性，結(jié)果表明，其感染豬在感染初期體溫很快升高至40℃以上，出現(xiàn)食欲不振、精神沉郁、咳嗽打噴嚏等癥狀，但在實(shí)驗(yàn)室條件下攻毒感染，21天內(nèi)豬只并沒(méi)有出現(xiàn)死亡，致病性低于HP-PRRSV毒株。血清中病毒滴度、N蛋白抗體水平與NADC30的較為相似[27]。CHsx1401感染豬只剖檢可見(jiàn)典型的間質(zhì)性肺炎和淋巴結(jié)充血腫脹，與Li等[16]報(bào)道的另一株類NADC30毒株HNjz15致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

為評(píng)估當(dāng)前商用疫苗對(duì)類NADC30新近流行株的交叉保護(hù)效果，本實(shí)驗(yàn)室分別選取了應(yīng)用較廣的譜系5（lineage 5）經(jīng)典毒株、譜系8（lineage 8）HP-PRRSV傳代致弱毒株以及本實(shí)驗(yàn)室分離的譜系8（lineage 8）經(jīng)典毒傳代致弱毒株進(jìn)行免疫攻毒實(shí)驗(yàn)。在平行使用病毒含量相同（2×105TCID50）的三種疫苗免疫28天后，對(duì)仔豬進(jìn)行CHsx1401毒株（2×105TCID50）攻毒感染，結(jié)果表明，三個(gè)疫苗免疫組和疫苗空白對(duì)照組豬只，在體溫反應(yīng)、臨床癥狀、肺臟眼觀病變、肺臟顯微病變，肺臟中抗原分布多個(gè)維度均呈現(xiàn)大致相同的結(jié)果，但三種疫苗免疫均對(duì)加速感染后病毒血癥的清除具有一定作用[26]。同時(shí)，Bai等[28]也系統(tǒng)評(píng)估了五種商用疫苗對(duì)類NADC30毒株HNjz15的保護(hù)效果，發(fā)現(xiàn)疫苗免疫對(duì)縮短攻毒豬的發(fā)熱時(shí)間、臨床表現(xiàn)和提升日增重有一定效果，但對(duì)病毒血癥、組織病理?yè)p傷和病毒載量并無(wú)影響。雖然兩個(gè)試驗(yàn)所用免疫劑量、攻毒毒株和攻毒劑量并不相同，其結(jié)果也略有差異，但結(jié)論卻是一致的：由于遺傳演化關(guān)系較遠(yuǎn)，當(dāng)前商用疫苗對(duì)新近流行的類NADC30毒株缺乏有效的交叉保護(hù)性。

4 類NADC30毒株的變異與重組

類NADC30毒株自傳入我國(guó)以來(lái)，已開(kāi)始在豬群中廣泛傳播，對(duì)該類毒株的分離鑒定以及序列測(cè)定的報(bào)道逐年增加，其數(shù)據(jù)表明，我國(guó)類NADC30毒株與美國(guó)分離株NADC30的親緣關(guān)系逐漸降低，但在基于ORF5或全基因組的進(jìn)化樹(shù)中，類NADC30毒株仍然與NADC30、MN184A、MN184B以及MN184C等譜系1（lineage 1）的美國(guó)分離株處于同一分支。在類NADC30毒株變異過(guò)程中，除了核苷酸（氨基酸）的替換以及新近發(fā)現(xiàn)的ORF5編碼區(qū)單個(gè)氨基酸的缺失，最主要的是與其他毒株的重組。Zhao等[29]在2015年最早報(bào)道了類NADC30毒株與HP-PRRSV毒株的重組毒JL580，在人工感染試驗(yàn)中該毒株對(duì)6周齡仔豬呈現(xiàn)100%的致死率，作者推測(cè)類NADC30的傳入以及與國(guó)內(nèi)毒株的重組是導(dǎo)致2013—2014年間大量PRRS案例暴發(fā)的重要原因。其后本實(shí)驗(yàn)室也在2015年分離到一株類NADC30與HP-PRRSV致弱活疫苗重組的嵌合毒TJnh1501，其致病性高于兩株親本毒。近期，我們對(duì)2015—2017年間登陸GenBank的292株中國(guó)毒株進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)30株重組毒株，其中24株為類NADC30毒株重組毒，且隨著年份的推進(jìn)，重組毒的比例逐年增加。結(jié)果表明，類NADC30毒株極易與其他病毒重組，但其分子機(jī)制目前尚有待研究。

5 展望與思考

類NADC30毒株為何流行比例會(huì)迅速上升，甚至有成為田間主要流行株的可能，推測(cè)有以下幾個(gè)原因：⑴當(dāng)前疫苗對(duì)其保護(hù)性不足，所免疫豬群仍能夠感染發(fā)病，并進(jìn)一步排毒，利于毒株擴(kuò)散。⑵推測(cè)類NADC30毒株有可能復(fù)制保真性更差，更容易變異，這樣的毒株在適應(yīng)宿主的過(guò)程中有更大的優(yōu)勢(shì)。⑶類NADC30毒株容易重組，重組之后，經(jīng)宿主篩選，可能出現(xiàn)增殖能力更強(qiáng)、更能免疫逃逸的毒株。

總之，臨床流行毒株的多樣性，以及自身的易變異

性和目前商用疫苗對(duì)其交叉保護(hù)效率的不足，是導(dǎo)致新近類NADC30毒株廣泛流行、難以控制的重要原因。

[24] Zhou L,Kang R,Ji G,et al.Molecular characterization and recombination analysis ofporcine reproductive and respiratory syndrome virus emerged in southwestern China during 2012-2016[J].Virus Genes,2017.doi:10.1007/s11262-017-1519-y.

[25] Zhou Z,Wu J,Zhang S,et al.Analysis of genetic variation of two NADC30-like strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China[J].Open Virology Journal,2017,11:90-97.

[26] Zhou L,Wang Z,Ding Y,et al.NADC30-like Strain of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,China[J].Emerging Infectious Diseases,2015,21(12):2256-2257.

[27] Zhou L,Yang B,Xu L,et al.Efficacy evaluation of three modified-live virus vaccines againsta strain ofporcine reproductive and respiratory syndrome virus NADC30-like[J].Veterinary Microbiology,2017,207:108-116.

[28] Bai X,Wang Y,Xu X,et al.Commercial vaccines provide limited protection to NADC30-like PRRSV infection[J].Vaccine,2016,34(46):5540-5545.

[29] Zhao K,Ye C,Chang XB,et al.Importation and recombination are responsible for the latest emergence of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China[J].Journal of Virology,2015,89(20):10712-10716.

[1] Rossow KD.Porcine reproductive and respiratory syndrome[J].Veterinary Pathology,1998,35(1):1-20.

[2] Keffaber KK.Reproductive failure of unknown etiology[J].Am Assoc Swine Pract Newslett,1989,1(1):9.

[3] Wensvoort G,Terpstra C,Pol JM,et al.Mystery swine disease in the Netherlands:the isolation of Lelystad virus[J].Veterinary Quarterly,1991,13(3):121-130.

[4] Hopper JL.The epidemiology of genetic epidemiology[J].Acta Genet Med Gemellol(Roma),1992,41(4):261-273.

[5] Meulenberg JJ,Petersen den Besten A,de Kluyver E,et al.Molecular characterization of Lelystad virus [J].Veterinary Microbiology,1997,55(1-4):197-202.

[6] Meulenberg JJ.PRRSV,the virus[J].Veterinary Research,2000,31(1):11-21.

[7] Shi M,Lam TY,Hon CC,et al.Phylogeny-Based evolutionary,demographical,and geographical dissection of North American Type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome viruses[J].Journal of Virology,2010,84(17):8700-8711.

[8] Guo B,Chen Z,Liu W,et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus was isolated from abortive fetus of suspected PRRS [J].Chinese Journal of Animal and Poultry Infectious Disease,1996,87(2):1-5.

[9] Han J,Zhou L,Ge X,et al.Pathogenesis and control of the Chinese highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Veterinary Microbiology,2017,209:30-47.

[10] Chen N,Cao Z,Yu X,et al.Emergence of novel European genotype porcine reproductive and respiratory syndrome virus in mainland China[J].Journal of General Virology,2011,92(Pt 4):880-892.

[11] 楊漢春,管山紅,尹曉敏,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離與初步鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,1997,23(10):9-10.

[12] Gao ZQ,Guo X,Yang HC.Genomic characterization of two Chinese isolates of porcine respiratory and reproductive syndrome virus[J].Archives of Virology,2004,149(7):1341-1351.

[13] Tian K,Yu X,Zhao T,et al.Emergence of fatal PRRSV variants:unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark[J].Plos One,2007,2(6):e526.

[14] Zhou L,Yang H.Porcine reproductive and respiratory syndrome in China[J].Virus Research,2010,154(1-2):31-37.

[15] Zhou L,Chen SX,Zhang JL,et al.Molecular variation analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China[J].Virus Research,2009,145(1):97-105.

[16] Li C,Zhuang J,Wang J,et al.Outbreak Investigation of NADC30-like PRRSV in South-East China[J].Transboundaryamp;Emerging Diseases,2016,63(5):474-479.

[17] Li X,Bao H,Wang Y,et al.Widespread of NADC30-like PRRSV in China:Another Pandora's box for Chinese pig industry as the outbreak of highly pathogenic PRRSV in 2006[J].Infection,genetics and evolution:journal of molecular epidemiology and evolutionary genetics in infectious diseases,2017,49:12-13.

[18] Li X,Wu J,Tan F,et al.Genome characterization of two NADC30-like porcine reproductive and respiratory syndrome viruses in China[J].Springerplus,2016,5(1):1677.

[19] Li Y,Ji G,Wang J,et al.Complete genome sequence of an NADC30-like porcine reproductive and respiratory syndrome virus characterized by recombination with other strains[J].Genome Announcements,2016,4(3):e00330-16.

[20] Liu JK,Zhou X,Zhai JQ,et al.Emergence of a novel highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China[J].Transboundaryamp;Emerging Diseases,2017,64(6):2059-2074.

[21] Tian K.NADC30-like porcine reproductive and respiratory syndrome in China[J].Open Virology Journal,2017,11:59-65.

[22] Wang LJ,Guo Z,Qiao S,et al.Complete genome sequence of a mosaic NADC30-like porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China[J].Genome Announcements,2016,4(6):e01428-16

[23] Wang LJ,Wan B,Guo Z,et al.Genomic analysis of a recombinant NADC30-like porcine reproductive and respiratory syndrome virus in china[J].Virus Genes,2017(Pt 2):1-12.

S852.65

A

1673-4645(2017)11-0020-04

2017-11-20

國(guó)家自然科學(xué)基金（31772759）

*通訊作者：周磊（1981-），男，博士，副教授，主要從事豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）等病毒性傳染病的分子致病機(jī)理、遺傳變異規(guī)律以及感染與免疫機(jī)理研究，E-mail：leosj@cau.edu.cn

收稿日期：2017-10-31

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金（JC2017010），中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（Y2017JC16），哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項(xiàng)資金（2016RAQXJ142）

安同慶（1978-），男，博士，研究員，主要從事動(dòng)物病毒分子生物學(xué)研究，E-mail：antongqing@caas.cn