外陰疾病中RhoA的表達(dá)及意義

崔丹丹 武昕

外陰疾病中RhoA的表達(dá)及意義

崔丹丹 武昕

目的探討外陰疾病中RhoA的表達(dá)情況,分析其與外陰疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。方法采用免疫組化方法檢測(cè)RhoA在外陰硬化性苔蘚及外陰鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá),并收集外陰鱗狀細(xì)胞癌患者的臨床病理資料進(jìn)行分析。結(jié)果RhoA在外陰硬化性苔蘚中的表達(dá)為(44.07±1.45),顯著高于其在外陰正常皮膚中的表達(dá)(31.22±2.46)(P＜0.05)。在外陰鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)為(77.22±3.08),顯著高于其在外陰硬化性苔蘚與外陰正常皮膚中的表達(dá)(P＜0.05)。RhoA在Ⅰ～Ⅱ期外陰磷狀細(xì)胞癌中表達(dá)為(71.83±4.31),Ⅲ～Ⅳ期為(82.05±1.32),比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；在不同病理分級(jí)中表達(dá)為：高分化(71.22±2.89),中低分化(75.05±2.78),比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中為(78.21±1.71),明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的(63.31±2.51)(P＜0.05)；RhoA的表達(dá)與年齡及細(xì)胞分化無(wú)關(guān)。結(jié)論RhoA的表達(dá)與外陰磷狀細(xì)胞癌及外陰硬化性苔癬的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

RhoA；外陰鱗狀細(xì)胞癌；外陰硬化性苔蘚；免疫組化

Rho家族蛋白是小G蛋白家族中的成員之一,其具有三磷酸鳥(niǎo)苷(GTP)酶活性,Rho家族蛋白在基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期調(diào)控、膜泡運(yùn)輸中起重要作用。文獻(xiàn)顯示,RhoA在人類多種惡性腫瘤中異常表達(dá),如食管癌、胃癌、宮頸癌等,并在其發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［1-3］。

外陰硬化性苔癬(vulvar lichen sclerosus,VLS)是常見(jiàn)的外陰上皮非內(nèi)瘤樣病變,可發(fā)生于任何年齡,以40歲左右的婦女多見(jiàn),是一種潛在的癌前病變。其中約有4%～7%患有外陰硬化性苔蘚的婦女發(fā)展為外陰癌［4］。外陰鱗狀上皮癌占外陰惡性腫瘤的80%以上,約60%左右患者合并有外陰硬化性苔蘚［5］。目前兩種疾病的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全弄清,并且外陰硬化性苔蘚在什么情況下會(huì)進(jìn)展為外陰磷狀細(xì)胞癌尚不清楚。因此本研究運(yùn)用免疫組化的方法探討RhoA的表達(dá)與外陰硬化性苔癬和外陰磷狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展是否相關(guān)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2007～20012年中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理教研室經(jīng)手術(shù)切除或活檢存檔的蠟塊；其中外陰磷狀細(xì)胞癌60例,外陰硬化性苔蘚30例,外陰正常皮膚20例。所有患者病理資料完整,術(shù)前均未行放化療及物理治療,標(biāo)本均經(jīng)2位資深病理醫(yī)師鏡下確認(rèn)。收集外陰鱗狀細(xì)胞癌患者的詳細(xì)臨床病理資料,年齡33～72歲,平均年齡(50.1±7.3)歲。根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)(2009年)臨床分期：Ⅰ期16例,Ⅱ期30例,Ⅲ期10例,Ⅳ期4例；分化程度：高分化者36例,中分化者14例,低分化者10例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者16例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 兔抗人RhoA多克隆抗體、即用型SABC試劑盒,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液均購(gòu)自北京博奧森生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化方法檢測(cè) 石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟水化。并置于3%過(guò)氧化氫(H2O2)室溫孵育20 min從而滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,再進(jìn)行抗原修復(fù),滴加5%BSA封閉液,室溫20 min,滴加適當(dāng)一抗RhoA(1:200)于4℃冰箱過(guò)夜,再滴加相對(duì)應(yīng)的二抗生物素化山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)孵育30 min,滴加鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物工作液,并在室溫下孵育20 min,隨后進(jìn)行DAB顯色,最后蘇木素復(fù)染封片。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照片。

1.3.2 結(jié)果判定 在光學(xué)顯微鏡下觀察,以細(xì)胞漿或細(xì)胞膜出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒者則認(rèn)定為陽(yáng)性,運(yùn)用BX60萬(wàn)能顯微照相系統(tǒng)(OLYMPUS,日本)對(duì)切片進(jìn)行圖像采集,利用顯微圖像分析系統(tǒng)對(duì)采集的圖像進(jìn)行積分光密度值測(cè)定,每張切片分別選取5個(gè)不同視野,計(jì)算同一張切片的平均積分光密度值,則代表陽(yáng)性染色細(xì)胞在該組織中的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RhoA在外陰正常皮膚組織、外陰硬化性苔蘚及外陰磷狀細(xì)胞癌中的表達(dá) RhoA蛋白陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞漿及細(xì)胞膜,呈棕黃色顆粒。在外陰正常皮膚中陽(yáng)性細(xì)胞分布于基底細(xì)胞層,表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值為(31.22±2.46)；在外陰硬化性苔癬中陽(yáng)性細(xì)胞位于表皮中上層,在真皮細(xì)胞中不表達(dá),表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值為(44.07±1.45),外陰正常皮膚與外陰硬化性苔癬表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。RhoA在外陰鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞分布在癌巢中,表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值為(77.22±3.08),顯著高于其在外陰硬化性苔癬與外陰正常皮膚中的表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 RhoA的表達(dá)與外陰鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系RhoA在Ⅰ～Ⅱ期外陰磷狀細(xì)胞癌中表達(dá)為(71.83±4.31),Ⅲ～Ⅳ期為(82.05±1.32),比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；在不同病理分級(jí)中表達(dá)為：高分化(71.22±2.89),中低分化(75.05±2.78),比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中為(78.21±1.71),明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的(63.31±2.51),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；RhoA的表達(dá)與年齡無(wú)關(guān)(P＞0.05)。

3 討論

Rho(ras homologous) 家族蛋白是Ras 超家族中小分子量G蛋白的成員之一,包括有RhoA、B、C、D和E等蛋白。RhoA全稱為Ras同源類似物A,其基因全長(zhǎng)約16 kb,定位于3p21.3。RhoA含有高度保守的二磷酸鳥(niǎo)苷(GDP)/GTP結(jié)合區(qū)和GTP酶活性區(qū),當(dāng)與GDP結(jié)合時(shí)處于非活性狀態(tài),而與GTP結(jié)合時(shí)則處于活性狀態(tài),此外還具有靶區(qū)和膜定位結(jié)構(gòu)。同異三聚體G蛋白一樣,通過(guò)無(wú)活性GDP狀態(tài)和活性GTP狀態(tài)方式的轉(zhuǎn)換發(fā)揮其重要的分子開(kāi)關(guān)作用。本研究結(jié)果證實(shí)RhoA在外陰硬化性苔蘚中的表達(dá)顯著高于外陰正常組織,提示RhoA參與外陰硬化性苔蘚病變的發(fā)生,其可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞分裂等生物學(xué)行為參與外陰硬化性苔蘚病變的發(fā)生,具體機(jī)制則有待進(jìn)一步研究探討。

本研究顯示RhoA在外陰磷狀細(xì)胞癌中的表達(dá)顯著高于外陰正常皮膚,并且在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期高的病例中高表達(dá)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［6-8］,處于活性狀態(tài)的RhoA可促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移,其機(jī)制可能為:①調(diào)控下游效應(yīng)蛋白R(shí)OCK或mDia,調(diào)節(jié)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白微絲骨架的聚合、導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白微絲的重排,加強(qiáng)細(xì)胞遷移能力;②使細(xì)胞周期素D1(Cyclin D1)的表達(dá)上調(diào)、抑制p21WAF1和p27KIPl的表達(dá),將細(xì)胞阻滯于G1和G2/M期,從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng);③使上皮型鈣粘素(E-cadherin)表達(dá)下調(diào),破壞腫瘤細(xì)胞間粘附;④調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP9)的活性從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解;⑤調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、環(huán)氧合 酶-2(COX-2)促進(jìn)新生血管生成;基因轉(zhuǎn)錄激活激活蛋白-1(AP-1)、核因子κB(NF-κB)、血清反應(yīng)因子(SRF)等核轉(zhuǎn)錄因子,這些核轉(zhuǎn)錄因子可使腫瘤相關(guān)基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄。另外,RhoA在外陰磷狀細(xì)胞癌中的表達(dá)顯著高于外陰硬化性苔蘚(P＜0.05)。這與其惡性轉(zhuǎn)化的能力相關(guān)。RhoA具有癌基因的功能,它可引起胸腺細(xì)胞的錨定非依賴性生長(zhǎng)并可導(dǎo)致胸腺細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤,提示RhoA具有對(duì)胸腺細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化能力。RhoA還通過(guò)降低轉(zhuǎn)錄因子甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子 1(TTF 1)的活性介導(dǎo)了Ras對(duì)胸腺細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化,抑制RhoA的功能表達(dá)可逆轉(zhuǎn)這一轉(zhuǎn)化作用。

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Expression and significance of RhoA in vulvar disease

CUI Dan-dan,WU Xin.Shenyang City Maternal and Infantile Hospital,Shenyang 110000,China

ObjectiveTo investigate expression of RhoA in vulvar disease,and to analyze its relationship with occurrence and development of vulvar disease.MethodsImmunohistochemistry method was applied to detected expression of RhoA in lichen sclerosus of vulva and vulvar squamous cell carcinoma.Clinical and pathological data of vulvar squamous cell carcinoma patients were collected for analysis.ResultsExpression of RhoA in lichen sclerosus of vulva was obviously higher as(44.07±1.45) than(31.22±2.46) in normal vulvar skin(P＜0.05).Expression of RhoA in vulvar squamous cell carcinoma was much higher as(77.22±3.08) than those in lichen sclerosus of vulva and normal vulvar skin(P＜0.05).Expression of RhoA was(71.83±4.31) in stage Ⅰ～Ⅱvulvar squamous cell carcinoma and(82.05±1.32) in stage Ⅲ～Ⅳ,and the difference had statistical significance(P＜0.05).Expression in different pathological classification was(71.22±2.89) in high differentiation and(75.05±2.78) in low differentiation.There was no statistically significant difference between high differentiation and low differentiation(P＞0.05).Expression in lymphatic metastasis was obviously higher as(78.21±1.71) than(63.31±2.51) in non-lymphatic metastasis(P＜0.05).Expression of RhoA was not ralted with age and cell differentiation.ConclusionExpression of RhoA is related with occurrence and development of vulvar squamous cell carcinoma and lichen sclerosus of vulva.

RhoA; Vulvar squamous cell carcinoma; Lichen sclerosus of vulva; Immunohistochemistry

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.01.027

2016-12-09］

110000 沈陽(yáng)市婦嬰醫(yī)院(崔丹丹)；中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科(武昕)

武昕