豬偽狂犬病疫苗的研究進展

牛曉蕓 賴月輝 黃秋雪 牛貝貝 吳文福

（廣東永順生物制藥股份有限公司，廣東廣州 511356）

豬偽狂犬病疫苗的研究進展

牛曉蕓 賴月輝 黃秋雪 牛貝貝 吳文福

（廣東永順生物制藥股份有限公司，廣東廣州 511356）

偽狂犬病是影響?zhàn)B豬業(yè)的重要傳染病，一旦發(fā)病很難根除，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。本病目前尚無有效藥物治療，免疫接種是預(yù)防和控制本病的主要措施。本文綜述了目前防治偽狂犬病主要使用的滅活疫苗、弱毒疫苗和基因疫苗3類疫苗，并展望了未來偽狂犬病疫苗的發(fā)展方向。

豬偽狂犬?。灰呙?；研究進展

偽狂犬病（Pseudorabies,PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）引起的一種急性烈性傳染病，宿主范圍廣泛，可感染豬、牛、羊和野生動物等[1]。感染豬的臨床癥狀均表現(xiàn)為體溫升高。新生仔豬表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀，消化系統(tǒng)受損害，死亡率高達100%；妊娠母豬感染后可引起流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎和呼吸系統(tǒng)臨床癥狀；公豬表現(xiàn)為繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)臨床癥狀。本病廣泛分布于世界各國，在我國也廣泛存在。PRV有極強的免疫逃逸能力，造成免疫系統(tǒng)受到損害，易繼發(fā)其他疾病，嚴重威脅養(yǎng)殖業(yè)，每年給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[2]。本病目前無有效的藥物治療，并且PRV引起成年豬的隱性感染。疫苗免疫接種仍是預(yù)防和控制本病的主要措施。

早期的疫苗主要是滅活疫苗和弱毒活疫苗。隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PR基因苗等新興疫苗也隨之誕生，本文就PR各種疫苗做一簡單的綜述。

1 滅活疫苗

PR滅活疫苗又稱死疫苗，是將PR強毒接種其敏感細胞，待細胞出現(xiàn)典型的病變后，收獲病毒，然后利用某些物理或化學(xué)方法將PRV殺死，并結(jié)合相應(yīng)的佐劑而制成的疫苗。滅活疫苗因為病毒已被滅活、安全性好，不存在潛伏感染的隱患，因而在各養(yǎng)豬場，尤其是在種豬場以及未污染的養(yǎng)豬場廣泛應(yīng)用，甚至有些國家和地區(qū)對于種豬要求使用滅活苗。

李曉慧等[3]利用PRV四川株研制油佐劑滅活疫苗，試驗證明：免疫效果良好，抗體持續(xù)時間達6個月。Wang等[4]在PRV AH02LA毒株的基礎(chǔ)上缺失gE基因，構(gòu)建了感染性克隆PRV（LA-AB）株，將該克隆株滅活后加以佐劑制備的滅活疫苗，能提供完全臨床保護。PRV可導(dǎo)致母豬的繁殖障礙，很多養(yǎng)殖企業(yè)會對母豬進行產(chǎn)前的加強免疫，新生仔豬獲得較高的母源抗體，但母源抗體會干擾PR弱毒活疫苗的免疫效果，而免疫接種PR滅活疫苗，則能起到很好的保護作用。舒銀輝等[5]用其研制的PR滅活疫苗（HB-J株）以不同劑量免疫健康斷奶仔豬，試驗結(jié)果表明該疫苗能使豬產(chǎn)生良好的體液免疫應(yīng)答，并且具有一定的劑量依賴性。該學(xué)者的研究還介紹了滅活疫苗的缺點：接種滅活疫苗只產(chǎn)生體液免疫，很少或不引起細胞免疫；產(chǎn)生的抗體滴度隨著時間而下降，為了得到良好的免疫效果，經(jīng)常要大劑量注射或者重復(fù)免疫接種，給防疫工作帶來諸多不便；市售的滅活疫苗大都以白油做佐劑，在機體內(nèi)不易吸收，接種后偶爾會發(fā)生過敏反應(yīng)；且生產(chǎn)過程也比較繁瑣、費用高，故在生產(chǎn)上已經(jīng)較少使用。

2 弱毒活疫苗

2.1 第一代弱毒活疫苗

第一代弱毒活疫苗為天然基因缺失株，比較經(jīng)典的是 Bartha-K61株活疫苗和 BUK株 活疫苗 。Bartha-K61株活疫苗是二十世紀六十年代匈牙利Bartha等人將野毒株在雞胚成纖維細胞上反復(fù)傳代、篩選噬斑而獲得的一個致弱疫苗株，該毒株為gE-基因缺失株，也有研究顯示gE-基因相鄰的gI也存在部分缺失[6]。Bartha-K61株毒力弱、免疫原性好、遺傳特性穩(wěn)定，是公認的優(yōu)良疫苗株。在Zhou等[7]的研究中顯示，應(yīng)用Bartha-K61疫苗，無論是一次免疫還是二次免疫都能很好地抵抗PRV經(jīng)典強毒和野毒株的攻擊，而二次免疫后豬只有更好的增重情況。目前我國免疫防控PR應(yīng)用最多的是Bartha-K61株活疫苗。

另一個經(jīng)典天然基因缺失毒株BUK也是gE-基因，是親本毒株在細胞連續(xù)傳代后致弱而來。20世紀后，許多國家利用親本野毒株在一定條件下致弱培育了不少PR弱毒疫苗株，如：北愛爾蘭的NIA4株、法國Alfort-26株、保加利亞MK25株、俄羅斯lt-21/07株（該毒株是將MK-25弱毒株進一步減弱獲得）。

在感染地區(qū)，應(yīng)用第一代弱毒活疫苗進行普遍免疫，在根除的最后階段對仍然是陽性的豬群進行撲殺，最后實現(xiàn)PRV野毒株的根除。有研究證實，德國東部部分地區(qū)應(yīng)用第一代弱毒活疫苗實現(xiàn)了PRV的凈化[8]。

2.2 第二代弱毒活疫苗

自然弱毒疫苗免疫效果好，但其主要毒力基因TK基因并沒有缺失，還存在毒力返強、傳毒和散毒的風(fēng)險。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對PRV基因組研究不斷的深入，更進一步了解基因組結(jié)構(gòu)對病毒生物學(xué)性質(zhì)和免疫原性的影響，第二代弱毒活疫苗——基因缺失疫苗應(yīng)運而生。

PRV基因組為線狀雙股DNA，只有一個血清型，其毒力由幾種基因協(xié)同控制，其中TK基因是主要的毒力基因，TK基因一旦失活，PRV對宿主的毒力將明顯降低或者喪失，第一個基因缺失弱毒活疫苗就是以TK基因缺失株為毒株制備的[9]，并于1986年在美國批準上市。中國最早進行基因缺失疫苗研究的是四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心，并成功構(gòu)建PRV Fa株TK基因缺失疫苗株，隨后又構(gòu)建了多株基因缺失疫苗株，同時四川農(nóng)業(yè)大學(xué)郭萬柱教授團隊研制的豬偽狂犬?。ɑ蛉笔В┗钜呙纾⊿A215）在2003年獲得新獸藥證書，為我國第一株動物病毒基因工程疫苗。

TK基因為酶蛋白基因，在體內(nèi)不能產(chǎn)生相應(yīng)抗體，僅缺失TK基因無法用血清學(xué)方法區(qū)分野毒感染株和免疫接種株，在TK缺失疫苗的基礎(chǔ)上雙基因缺失苗、三基因缺失苗、含報告基因的缺失疫苗發(fā)展開來。

Quint等[10]1987年構(gòu)建TK-/gE-雙基因缺失株并建立gE-ELISA血清學(xué)診斷方法，用于區(qū)別免疫接種和自然感染。Kit等[11]在PRV BUK-d13株的基礎(chǔ)上，構(gòu)建缺失TK和gC基因的PRV TK-/gC-疫苗株，PRV BUK-d13株本身存在gE基因缺失，動物在免疫接種該缺失疫苗后不能產(chǎn)生抗gC和gE抗體，用gC-ELISA或gE-ELISA可將免疫接種還是野毒感染動物區(qū)分開。何啟蓋[12]實驗室構(gòu)建TK和gG雙基因缺失株P(guān)RV HB-98株，生物學(xué)特性研究結(jié)果表明PRV HB-98突變株雙基因缺失株安全性和穩(wěn)定性好，并能在接種的動物中激發(fā)較強的免疫反應(yīng)，結(jié)合gG-ELISA可以區(qū)分疫苗接種動物和野毒感染動物。田志軍等[13]在Bartha-K61株的基礎(chǔ)上構(gòu)建了 Bartha-K61株 TK基因缺失突變株rPRV-LacZ，該重組病毒表型為gE-/TK-/Lacz+，rPRV-LacZ對3日齡仔豬和綿羊均具有很好的安全性。Dong等[14]以偽狂犬強毒株P(guān)RV ZJ01株為親本，構(gòu)建TK/gE/gI三基因缺失毒株rZJ01ΔTK/gE/gI株，并對其毒力和免疫原性進行研究。劉正飛等[15]以其實驗室分離鑒定的PRV Ea株為基礎(chǔ)，構(gòu)建PRV Ea TK-/gE-/gI-株。胡艷芬[16]以親本株P(guān)RV-JSZ基因組DNA為基礎(chǔ)并結(jié)合rPRV-TK-/gE-基因組DNA，構(gòu)建rPRV-TK-/gE-/gN-缺失株。姜焱等[17]在PRV上海株gI和gE基因克隆鑒定的基礎(chǔ)上，將綠色熒光蛋白（GFP）和Lac Z基因插入到缺失位置，構(gòu)建含Lac Z和GFP兩種篩選標記的PRV-SH gE-/gI-的雙基因缺失病毒株。

但是基因缺失疫苗還存在一個重要的問題，那就是生物安全。病毒在自然狀態(tài)下可能與野毒株發(fā)生基因重組，或者核酸修補，使疫苗株原本缺失的基因恢復(fù)而重新獲得毒力。

不管是一代弱毒活疫苗還是二代弱毒活疫苗面臨的一個共同問題就是疫苗的儲存和運輸，弱毒疫苗必須低溫冷凍保存。現(xiàn)實中由于條件限制，很難保證實時低溫，這就大大影響了疫苗免疫效果，所以疫苗研發(fā)又延伸了一個新方向——耐熱保護劑活疫苗的研發(fā)。王穎等[18]用響應(yīng)面法（RSM）篩選并優(yōu)化PRV耐熱保護劑最佳配方，應(yīng)用最佳配方凍干的疫苗在2～8℃條件下保存24個月，病毒含量降低不超過0.5個滴度。目前已有PR耐熱保護劑活疫苗上市銷售。

3 PR新型疫苗

傳統(tǒng)的PR疫苗存在不安全性或免疫效果不理想等缺陷，同時不能抵抗?jié)摲腥竞涂朔冈纯贵w的干擾，已成為控制和消滅偽狂犬病的關(guān)鍵性制約因素。研制克服傳統(tǒng)疫苗缺陷的新型疫苗成為PR防治的迫切期望。以主要保護性抗原為基礎(chǔ)的新型疫苗成為研究熱點，亞單位疫苗、活病毒載體疫苗、核酸疫苗等新型疫苗，尤其是核酸疫苗，具有誘導(dǎo)抗體全面、無致病性、無潛伏感染的危險等優(yōu)點，開發(fā)潛力大，如果能對其進一步完善，尤其是進一步提高其保護效力、消除潛在生物安全隱患，將有望應(yīng)用于生產(chǎn)實踐，在有效預(yù)防和控制豬偽狂犬病中發(fā)揮重要作用。

3.1 PR亞單位疫苗

PR亞單位疫苗就是利用基因工程技術(shù)將PRV的保護性抗原基因克隆到真核或原核表達系統(tǒng)中，使保護性抗原基因高效表達，用獲得的產(chǎn)物制成的疫苗。目前已知的PRV的11種糖蛋白中，gB、gC、gD均能刺激機體產(chǎn)生中和抗體，是研究亞單位疫苗的首選蛋白。

免疫刺激復(fù)合物（ISCOM）是一種全新的抗原遞呈系統(tǒng)，對機體有免疫增強和抗原遞呈雙重作用，能同時刺激機體的體液免疫和細胞免疫，是新發(fā)展起來的一種亞單位疫苗。葉麗林等[19]以偽狂犬全病毒構(gòu)建PRV免疫刺激復(fù)合物，對兔的保護率為100%。把特定的囊膜蛋白整合入ISCOM中，可以區(qū)分免疫動物和野毒感染動物。Tsuda等[20]將PRV的糖蛋白gII和Quil-A基質(zhì)結(jié)合構(gòu)建ISCOMS，免疫仔豬后能抵抗PRV感染。Tulman提取PRV囊蛋白gC制備ISCOM亞單位疫苗。

亞單位疫苗因不含有核酸物質(zhì)，比較安全，接種后不會產(chǎn)生持續(xù)感染或潛伏感染，產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可以與自然感染相區(qū)分，有利于疫病的控制和消滅。但是亞單位疫苗生產(chǎn)成本高，免疫原性不及弱毒活疫苗及滅活疫苗，應(yīng)用受到限制。

3.2 PR活載體疫苗

PRV宿主范圍廣，基因組大（約145 kb），含有許多病毒非必需基因，病原離子重組或者缺失后，接種異源動物上進行試驗，對異源動物無影響，還能產(chǎn)生綜合性抗體。在PRV基因組中插入一個或多個外源抗原基因，插入外源基因后不影響PRV毒株的增殖，獲得的重組病毒不僅可以對PR進行免疫預(yù)防，還能產(chǎn)生針對其他病原的保護，且免疫原性持久，克服滅活疫苗或弱毒疫苗的諸多缺點。因此，構(gòu)建其重組病毒或病毒活載體疫苗成為研究熱點。

王新等[21]以PRV基因缺失疫苗株SA215為病毒載體，通過同源重組，構(gòu)建共表達PCV2 ORF2基因和綠色熒光蛋白基因重組偽狂犬病病毒SA215（C）株，結(jié)果表明，免疫小鼠能抵抗PRV Fa和PCV2強毒的攻擊。這為研制安全、有效的PCV2-PRV二價基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。鈔安軍等[22]用PCV2 ORF2基因與豬PRV弱毒HB98株成功構(gòu)建表達ORF2基因的重組病毒PGO，該重組病毒組能夠激發(fā)PCV2特異的淋巴細胞增殖效應(yīng)。徐靜等[23]將日本乙型腦炎病毒CQRC-1株的E基因和PRV通過克隆、轉(zhuǎn)染的方法獲得了表達JEV E蛋白的重組偽狂犬病病毒，命名為SA215（E）。李自力等[24]以PRV Ea株TK-/gG-/LacZ+突變株為載體構(gòu)建了一株表達乙型腦炎病毒PrM基因的重組偽狂犬病病毒，重組病毒免疫小鼠能誘導(dǎo)乙型腦炎特異性抗體和特異性細胞免疫應(yīng)答，同時能抵抗PRV強毒的攻擊。鄭寶亮等[25]將含有H3N2亞型豬流感病毒（SIV）血凝素（HA）基因的轉(zhuǎn)移載體pLTK-HA與PR疫苗毒株Bartha-K61的基因組共轉(zhuǎn)染Vero細胞，獲得了一株重組偽狂犬病病毒，命名為rPRV-HA。rPRV-HA的免疫接種對同亞型SIV攻擊具有較好的保護作用。

在豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒病2型以及豬細小病毒病等重要傳染病疫苗的研發(fā)過程中，以PRV為載體構(gòu)建的rPRV-CSFV、rPRV-PRRSV、rPRVFMDV、rPRV-PCV-2、rPRV-PPV等重組疫苗已有大量的研究報道。

活載體疫苗克服滅活疫苗和弱毒活疫苗的部分缺陷，可以同時啟動機體體液免疫和細胞免疫，有實現(xiàn)一苗防多病的可能性，具有良好的研究和應(yīng)用前景。

3.3 PR核酸疫苗

核酸疫苗（nucleic acid vaccine），又稱基因疫苗（gene vaceine）或DNA疫苗（DNA vaccine），是將一種或多種抗原編碼基因克隆到真核表達載體上，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒直接注入動物體內(nèi)，抗原基因在宿主細胞內(nèi)表達而激活機體免疫系統(tǒng)。DNA疫苗可同時誘導(dǎo)體液免疫和細胞免疫、易構(gòu)建與改造、制備工藝簡單、不受母源抗體干擾、可以重復(fù)使用等，這些優(yōu)點是傳統(tǒng)疫苗無法比擬的。

Motail等于1996年首次將該技術(shù)用于偽狂犬病毒的研究。肖少波等[26]以pcDNA 3.1+和pSFV-DNA為載體，構(gòu)建gC基因的常規(guī)DNA疫苗表達質(zhì)粒pcDC和“自殺性”DNA疫苗表達質(zhì)粒pSFVC1.5（pSFVC1.5能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染細胞凋亡）。大量試驗結(jié)果顯示：“自殺性”DNA疫苗產(chǎn)生的中和抗體雖然沒有常規(guī)DNA疫苗高，但能誘導(dǎo)更強的細胞免疫；在免疫攻毒保護方面，“自殺性”DNA疫苗與常規(guī)DNA疫苗的抵抗PRV Ea強毒株攻擊的保護率分別為100%和62.5%，說明“自殺性”DNA疫苗能提供更好的免疫保護。陳懿等[27]以p3XFLAG為載體，分別構(gòu)建gD基因真核表達質(zhì)粒p3XFLAG-gD和 p3XFLAG-gD-VP22，分別免疫BALB/c小鼠，二免后攻擊PRV Ea強毒，結(jié)果兩組DNA疫苗對小鼠的保護率分別為87.5%和75%，并且p3XFLAG-gD-VP22質(zhì)粒能顯著誘導(dǎo)較強的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答。van Rooij[28,29]的試驗中將分別含有g(shù)B、gC、gD的DNA疫苗免疫新生仔豬，第三次免疫后攻擊PRV NIA3毒株，結(jié)果顯示，PRV-gB DNA疫苗可以誘導(dǎo)包括細胞毒性T細胞反應(yīng)在內(nèi)的細胞反應(yīng)，并且在感染早期可以減少病毒的排泄，PRV-gD DNA疫苗可以誘導(dǎo)強烈的中和抗體反應(yīng)。另外 van Rooij還進行了gB-gD DNA疫苗誘導(dǎo)新生仔豬免疫反應(yīng)的研究，結(jié)果表明，與常規(guī)疫苗相比，gB-gD DNA疫苗，能夠誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生更高水平的體液免疫和細胞免疫，并且免疫效果不受母源抗體的干擾。

4 總結(jié)和展望

PRV雖然只有一個血清型，但是不同的毒株毒力存在差異；宿主范圍廣，病毒與不同宿主的作用機制還沒有徹底闡明；潛伏感染機制尚不明確，目前還沒有一種有效的消除方法，有效的疫苗免疫在PRV的預(yù)防中起著至關(guān)重要的作用。

理想的疫苗應(yīng)該有效、安全、通用，可以區(qū)分免疫和野毒感染，價格低廉，操作簡便等。PR疫苗，目前以滅活疫苗和弱毒疫苗在臨床上使用較多，亞單位疫苗、核酸疫苗以及以PRV疫苗株為載體的多價疫苗大多還處于實驗室階段，新型疫苗商品化任重而道遠。隨著分子生物學(xué)研究的不斷發(fā)展和基因工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用，對PRV固有免疫逃逸機制的不斷發(fā)現(xiàn)，期望PR疫苗的研究在不久的將來有更新的突破并應(yīng)用于臨床。

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：1673-4645(2017)08-0071-05

2017-07-11

牛曉蕓（1986-），女，碩士，獸醫(yī)師，E-mail：ndsy2010@163.com