染色體畸變分析估算生物劑量的實踐與體會

榮曙，于旭，毛應(yīng)華，楊龍

染色體畸變分析估算生物劑量的實踐與體會

榮曙，于旭，毛應(yīng)華，楊龍

本文結(jié)合疾病預(yù)防控制中心醫(yī)學(xué)防護所的日常工作，對染色體畸變分析估算生物劑量的應(yīng)用和估算方法進行了簡要介紹，分析了當前存在的主要問題，提出解決的對策。

染色體制備；染色體畸變分析；生物劑量估算；體會

近年來，隨著核技術(shù)與核能的廣泛應(yīng)用，核與輻射事故的潛在危險悄然增加，再加上國內(nèi)外加緊對核恐怖事件的防范，生物劑量估算在核戰(zhàn)爭、放射性事故、職業(yè)和大眾的輻射安全和衛(wèi)生防護等方面的重要性已被世界各國所認識和重視。染色體畸變分析用作生物劑量估算已有50多年的歷史，可靠性已通過大量數(shù)據(jù)得到確認，被認為在事故劑量估算中是一種最可信賴的輻射生物計量方法。本文結(jié)合疾病預(yù)防控制中心醫(yī)學(xué)防護所當前的工作任務(wù)，對染色體畸變分析估算生物劑量在日常工作中的應(yīng)用和估算方法進行總結(jié)，將相關(guān)問題及建議報告如下。

1 染色體畸變分析在生物劑量估算中的應(yīng)用

1.1 染色體畸變可作為小劑量輻射生物效應(yīng)的特異性敏感指標隨著人們對電離輻射認識的不斷深入，輻射防護越來越受到重視，職業(yè)工作人員的防護意識也逐漸提高。放射工作人員所受的職業(yè)危害主要是長期的慢性小劑量電離輻射，一般認為，累積劑量低于100 mGy時，染色體畸變沒有明顯改變，當累積劑量大于100 mGy時，染色體畸變就可能明顯增加[1]。但近年來，多家機構(gòu)調(diào)查顯示，不同工種放射工作人員的淋巴細胞染色體畸變率均高于正常人群，而且可能隨著工齡的增加而逐漸增高[2-4]。因此，目前染色體畸變作為評價放射工作人員受照效應(yīng)的一種簡單而有價值的遺傳學(xué)指標被應(yīng)用于職業(yè)健康體檢中。

1.2 染色體畸變分析在輻射事故中的應(yīng)用生物劑量估算是核事故醫(yī)學(xué)應(yīng)急體系中非常重要的組成部分。用非穩(wěn)定性染色體畸變估算事故受照者的生物劑量，在國內(nèi)多次輻射事故處理過程中都起到了非常重要的作用[5-6]。輻射事故中，生物劑量可以和物理劑量互相驗證，互相補充。當未佩戴個人劑量計、無法用物理方法提供劑量時，或者估算的物理劑量與臨床表現(xiàn)不符合時，染色體畸變分析被認為是較為靈敏、估算劑量較可靠的首選方法。

2 染色體畸變分析估算生物劑量的方法

依據(jù)GBZ/T 248-2014《放射工作人員職業(yè)健康檢查外周血淋巴細胞染色體畸變檢測與評價》、GB/T 28236-2011《染色體畸變估算生物劑量方法》，參照相關(guān)專著[7-8]，并結(jié)合作者的實踐總結(jié)如下。

2.1 外周血淋巴細胞染色體標本制備（1）采血：采集靜脈血2 ml，予肝素抗凝。（2）培養(yǎng)：無菌條件下接種0.4 ml抗凝血至市售5 ml淋巴細胞培養(yǎng)液中，加入秋水仙素，使其濃度為0.03 mg/L，充分混勻，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～52 h后收獲。（3）低滲：終止培養(yǎng)后吸去上清培養(yǎng)液，加入預(yù)溫37℃的0.075 mol/L氯化鉀低滲液8 ml，移入離心管，混勻后置37℃水浴中放置30 min。（4）預(yù)固定：低滲取出后立即加入固定液（甲醇:冰醋酸＝3:1）1 ml輕輕混勻，1000 rpm離心10 min。（5）固定：吸去上清液，加入固定液8 ml混勻，室溫靜置30 min，然后1000 rpm離心10 min。棄固定液，以同樣方法再固定一次。（6）制片：吸棄固定液，根據(jù)沉淀物多少加入少量固定液，混勻，靜置10 min。將細胞懸液滴在冰水浸泡的玻片上，每片3滴，酒精燈上過火1～2次，然后自然干燥。（7）染色：Giemsa原液與磷酸緩沖液1:9混合配制染液，常規(guī)染色8 min左右，自來水沖洗玻片背面，置晾片架上晾干后待鏡檢。

2.2 染色體畸變分析在低倍鏡下尋找分散良好、長短適中的分裂相，換用油鏡對其進行仔細觀察，分析和記錄（46±1）個染色體的中期細胞。電離輻射誘發(fā)的畸變主要是染色體結(jié)構(gòu)的改變，包括染色單體型畸變和染色體型畸變。由于大部分化學(xué)誘變劑和環(huán)境中一些有害因素均可誘發(fā)單體畸變，故一般認為單體型畸變對輻射效應(yīng)評價意義不大。而染色體型畸變又可分為非穩(wěn)定性畸變和穩(wěn)定性畸變兩類，前者包括雙著絲粒（dic）、著絲粒環(huán)（r）和無著絲粒片段（ace），后者包括相互易位（t）、倒位（inv）和缺失（del）。放射工作人員職業(yè)健康檢查時主要分析計數(shù)dic、r和ace，以及明顯的非對稱性的t和del等。輻射事故生物劑量估算時只計數(shù)dic或dic+r，ace作為輔助指標。

2.3 放射工作人員染色體畸變檢測評價職業(yè)健康體檢時，每名受檢者至少分析100個中期分裂細胞。ace率大于3%，dic率、r率和t率大于或等于1%均為異常。作為慢性放射病診斷指標時還需至少增加分析100個中期分裂細胞。

2.4 輻射事故生物劑量估算根據(jù)鏡檢所得的dic或dic+r的畸變率，從相應(yīng)射線所建立的刻度曲線回歸方程估算受照劑量平均值，同時給出劑量范圍的95%可信區(qū)間。對估算劑量的個體，至少分析300～500個中期分裂細胞。但當大劑量急性照射時，通常分析100～200個中期分裂細胞就可滿足統(tǒng)計學(xué)要求。

3 染色體畸變分析估算生物劑量存在的難點及制定對策

3.1 染色體畸變標本制備成功的關(guān)鍵點染色體畸變是反映輻射損傷的良好指標，也是受人為影響很大的一項檢查。染色體標本制備從采血、培養(yǎng)、制片到分析全部為人工操作，環(huán)節(jié)多，時間長，其中任何一個環(huán)節(jié)處置不當都會影響畸變細胞的檢出率。應(yīng)特別注意以下這些方面：（1）收獲細胞前的所有步驟要保持無菌操作，防止污染。（2）加血量要適中。血液太少，細胞稀薄，細胞生長速度減慢；血液太多，會造成細胞營養(yǎng)不夠，影響其生長狀態(tài)。（3）秋水仙素的濃度和作用時間要準確控制。秋水仙素濃度過高，處理時間過長，不但產(chǎn)生細胞毒性作用使分裂相減少，而且染色體過于縮短，不宜進行分析；反之則不能有效阻斷細胞分裂，染色體瘦長或無中期分裂相。（4）低滲濃度和時間要適當。低滲過度，可使核膜破裂，染色體丟失；低滲不足則細胞膨脹不夠，染色體分散不開。（5）固定液要新鮮配制，否則會形成酯類，從而影響固定效果。（6）載玻片一定要非常干凈，并且經(jīng)0℃預(yù)冷，滴片時距離不小于50 cm，均有利于染色體的分散。此外，整個制備過程還需注意操作手法，減少不必要的細胞丟失。

3.2 染色體畸變分析估算生物劑量存在的問題（1）制片質(zhì)量的優(yōu)劣影響閱片效率和畸變的檢出率。由于染色體實驗影響因素眾多，制片質(zhì)量往往不穩(wěn)定，特別是在季節(jié)交替、溫濕度變化大的季節(jié)，或是某個試劑更換批次時，如不能及時調(diào)整實驗條件，制片效果就會不近人意，從而影響染色體的顯微觀察。（2）不同經(jīng)驗的技術(shù)人員判定畸變的準確率差異大。判斷染色體畸變需要分析人員有豐富的經(jīng)驗，一般有經(jīng)驗的分析人員dic+r畸變的準確率要高于新參加人員[9]。（3）多數(shù)實驗室沒有建立自己的劑量曲線。盡管用于生物劑量估算的染色體標本制備技術(shù)已有國家標準，對于畸變的描述也很清楚，但是這項技術(shù)完全是手工操作，尤其是畸變的判斷也全憑個人經(jīng)驗，因此如果不是用自己建立的劑量曲線估算，即使是同一劑量的標本，不同實驗室的估算結(jié)果也會有較大差異。

3.3 染色體畸變分析估算生物劑量難點制定對策（1）要想獲得高質(zhì)量的染色體片，必須做好染色體標本制備的質(zhì)量控制工作。染色體畸變標本制備的每個環(huán)節(jié)都很重要，出現(xiàn)失誤會影響最終制片效果，增加觀察的難度和檢查結(jié)果的偏離。因此必須從人員到設(shè)備、試劑、操作過程都嚴格按照質(zhì)量手冊規(guī)范，并不斷完善和總結(jié)經(jīng)驗，做好室內(nèi)質(zhì)控。（2）培養(yǎng)穩(wěn)定的團隊，通過集中學(xué)習(xí)和培訓(xùn)，加強技術(shù)人員業(yè)務(wù)知識培訓(xùn)，使之熟練掌握染色體標本制備技術(shù)和判斷、識別各種染色體畸變類型的能力，提高制片成功率和分析結(jié)果的準確率。目前，很多單位使用染色體自動掃描成像系統(tǒng)，這對制片和閱片的要求更高。（3）最大限度統(tǒng)一畸變分析標準，建立共同的劑量-效應(yīng)曲線。原則上劑量-效應(yīng)曲線的建立和劑量估算的分析人應(yīng)為同一人，這樣才能保證判斷標準的統(tǒng)一，但實際情況一般不能滿足該條件，這就需要實驗室內(nèi)部和實驗室之間判斷標準盡量一致。通過定期進行的實驗室間比對進行質(zhì)量控制，然后逐步建立起較為一致的劑量-效應(yīng)曲線，不僅能夠提升各實驗室生物劑量估算能力，還可提高同一時期樣本的處理量，為應(yīng)對大規(guī)模核與輻射事故的醫(yī)學(xué)救援工作做好技術(shù)準備。

[1]李秀芹，于瑞敏，趙進沛，等.染色體畸變研究方法及其在生物劑量估算中的應(yīng)用[J].中國輻射衛(wèi)生，2006，15（1）：116-117.

[2]劉征宇，楊學(xué)琴，惠長野，等.深圳市放射工作人員周圍血淋巴細胞染色體畸變分析[J].職業(yè)與健康，2013，29（13）：1549-1551.

[3]周齊紅，俞慧娟，付風(fēng)云，等.放射工作人員外周血淋巴細胞染色體畸變和微核率分析[J].中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2016，34（4）：275-277.

[4]周媛媛，王進，余寧樂，等.江蘇省2642名放射工作人員外周血淋巴細胞染色體畸變及微核率分析[J].職業(yè)與健康，2016，32（14）：1891-1893.

[5]劉建香，黃敏燕，阮健磊，等.哈爾濱事故受照者的生物劑量估算[J].中華放射醫(yī)學(xué)與防護雜志，2006，26（5）：460-462．

[6]秦永春，周獻鋒，熊曉蕓，等.南京銥-192放射源丟失事故受照者生物劑量估算[J].中國職業(yè)醫(yī)學(xué)，2016，43（3）：305-306.

[7]金璀珍.放射生物劑量估計[M].北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2002，166-172.

[8]吳德昌.放射醫(yī)學(xué)[M].北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2001，129-132.

[9]阮健磊，陸雪，陳德清，等.2007年全國染色體畸變分析估算輻射生物劑量比對[J].中國輻射衛(wèi)生，2008，17（3）：259-261.

（收稿：2016-11-10修回：2016-12-26編校：丁艷玲）

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2095-3496（2017）01-0040-03

10.19372/j.cnki.issn.2095-3496.2017.01.016

210002江蘇南京，原南京軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心（榮曙，于旭，毛應(yīng)華，楊龍）

楊龍，E-mail：nanjing.1978@163.com