黔北麻羊分子遺傳標(biāo)記研究進(jìn)展

沈洪良（蘇州工業(yè)園區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 215021）

黔北麻羊分子遺傳標(biāo)記研究進(jìn)展

沈洪良（蘇州工業(yè)園區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 215021）

分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)及免疫學(xué)等研究領(lǐng)域中。本文概述分子遺傳標(biāo)記的種類及其在黔北麻羊中的應(yīng)用情況，并對(duì)分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用前景提出展望。

黔北麻羊;分子遺傳;標(biāo)記;育種;研究進(jìn)展

黔北麻羊是貴州省三大優(yōu)良山羊品種之一,在貴州三大地方品種獨(dú)具特色,主要表現(xiàn)在分布地、毛色、體型外貌和生產(chǎn)性能等方面。黔北麻羊歷史悠久,發(fā)祥較早。以適應(yīng)能力強(qiáng)、耐粗飼、繁殖率高、肉性能良好、膻味輕、肉鮮美可口、板皮品質(zhì)優(yōu)良等優(yōu)點(diǎn)為當(dāng)?shù)厝罕娝拆B(yǎng)[1]。

自分子生物技術(shù)問(wèn)世以來(lái),分子遺傳標(biāo)記就為動(dòng)物遺傳育種學(xué)家所關(guān)注（Mats Hansen等,1997）[2],分子遺傳標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于分析動(dòng)物類群的群體遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性、動(dòng)物遺傳資源的分類、品系鑒定和遺傳純度分析、遺傳距離計(jì)算、雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè),遺傳關(guān)系確定、目的基因標(biāo)定、數(shù)量性狀基因的連鎖分析、構(gòu)建基因圖譜、疾病診斷等動(dòng)物遺傳育種研究領(lǐng)域。目前應(yīng)用在黔北麻羊遺傳育種中有以下幾種。

1 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）

1.1 基本原理

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction Fragment Length polymorphism,RFLP）是由不同基因型中內(nèi)切酶位點(diǎn)的堿基插入、缺失、重組或突變,利用限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA時(shí)會(huì)產(chǎn)生大小不同的DNA片段,電泳后通過(guò)Southern印跡法,將這些大小不同的DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜或尼龍膜上,同特異的探針進(jìn)行雜交,最后通過(guò)放射性自顯影或其他顯色技術(shù)顯示雜交結(jié)果,從而揭示出DNA的多態(tài)性（Lander,1989,Nienhuis,1987）[3,4]。

1.2 在黔北麻羊育種中的應(yīng)用

賈永紅等[5]（1999）采用15種內(nèi)切酶酶解貴州山羊的mtDNA,研究貴州省4個(gè)山羊品種之間的關(guān)系,其品種共93只個(gè)體線粒體DNA多態(tài)性。其中BamHI、HindⅢ和SalI3種酶的酶切類型存在多態(tài)。共檢測(cè)18種限制性態(tài)型,歸結(jié)為3種mtDNA單倍體,單倍體I和Ⅱ在貴州山羊4個(gè)品種中分布頻率較高,分別為77.42%和21.50%,單倍型Ⅲ分布頻率較低為1.08%：其中白山羊和黑山羊親緣關(guān)系最近,其次為黔北麻羊,而與小香羊的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。從而推測(cè)貴州山羊mtDNA單倍體I和Ⅱ可能來(lái)源于兩個(gè)母系先祖,分時(shí)間約在19萬(wàn)年前。

1.3 小結(jié)

PCR-RFLP由于其要用到內(nèi)切酶而使試驗(yàn)成本變大,加之多態(tài)含量不高不便于檢測(cè)未知序列突變等局限性,現(xiàn)在大多數(shù)研究者更多的應(yīng)用其他技術(shù)來(lái)代替PCR-RFLP。

2 隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD）

2.1 基本原理

隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD） 是 Williams（1990）[6]等人通過(guò)利用一系列不同的隨機(jī)排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈（通常為十聚體）為引物,對(duì)所研究基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分離,經(jīng)EB染色或放射自顯影來(lái)檢測(cè)其中DNA片段的多態(tài)性。

2.2 在黔北麻羊育種中的應(yīng)用

楊家大等（2002）[7]用擴(kuò)增豬基因組篩選得到40條多態(tài)引物對(duì)小香羊、馬頭羊、川東白山羊和江南黃羊4個(gè)品種進(jìn)行PAPD分析,擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離,結(jié)果有28條引物擴(kuò)增出多態(tài)性譜帶,并用Nei氏公式計(jì)算品種間的遺傳距離指數(shù),NJ發(fā)構(gòu)建系統(tǒng)聚類圖。結(jié)果表明,川東白山羊和江南黃羊之間的遺傳距離指數(shù)較小,親緣關(guān)系較近,而小香羊與其他山羊品種之間的遺傳距離指數(shù)較較大,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 小結(jié)

相對(duì)傳統(tǒng)酶學(xué)、RFLP等方法,RAPD具有快速、簡(jiǎn)便[8],無(wú)需預(yù)知受試基因組DNA序列等優(yōu)點(diǎn),并且避免放射性同位素污染。RAPD標(biāo)記還可以對(duì)那些RFLP難以區(qū)分的基因區(qū)域作遺傳連鎖圖。但RAPD標(biāo)記的重復(fù)性不太令人滿意[9],另外RAPD標(biāo)記難以區(qū)分開(kāi)雜合子和純合子基因型[10]。

3 微衛(wèi)星序列

3.1 基本原理

微衛(wèi)星序列（Microsatellite DNA）又稱為簡(jiǎn)單序列重復(fù)（Simple sequence repeats,SSR）或簡(jiǎn)單序列（Simple sequences）、短串聯(lián)重復(fù)序列 (Short randem repeat,STR),微衛(wèi)星序列在動(dòng)物群體內(nèi)通常具有很高的多態(tài)性,廣泛分布于生物體整個(gè)基因組,具有分布廣泛、多態(tài)性豐富、易于檢測(cè)、呈孟德?tīng)柟诧@性遺傳等特點(diǎn),被認(rèn)為是各類遺傳標(biāo)記中最有價(jià)值的一種標(biāo)記（Tautz D等1989,Hamada H等1982）。

3.2 在黔北麻羊育種中的應(yīng)用

毛鳳顯（2006）等[11]用15個(gè)牛微衛(wèi)星位點(diǎn),以波爾山羊?yàn)閷?duì)照,研究4個(gè)貴州地方山羊品種（貴州白山羊、貴州黑山羊、黔北麻羊育、榕江小香羊）的遺傳背景,結(jié)果反應(yīng)了牛微衛(wèi)星位點(diǎn)與山羊有較高同源性；貴州地方山羊品種比波爾山羊具有較高的遺傳性,高低順序是貴州白山羊＞貴州黑山羊＞黔北麻羊＞榕江小山羊＞波爾山羊；群體遺傳分化大,群體變異主要存在于品種內(nèi),而品種間的變異較小；貴州白山羊與貴州黑山羊遺傳距離最近,其次是榕江小山羊、黔北麻羊,與波爾山羊遺傳距離最遠(yuǎn),這與它們的地理分布及品種形成相符。

3.3 小結(jié)

微衛(wèi)星DNA一般位于內(nèi)含子中,在進(jìn)化過(guò)程中受到選擇壓力較小,與其他分子標(biāo)記相比,微衛(wèi)星DNA在多態(tài)性、群體平均雜合度,以及群體間遺傳距離等方面,微衛(wèi)星位點(diǎn)均值高于蛋白質(zhì)位點(diǎn)。用微衛(wèi)星標(biāo)記更適合于其分析。同樣更適合于檢測(cè)個(gè)體間的差異。

4 單核苷酸多態(tài)性（SNP）

4.1 基本原理

單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism,SNP）是指在基因組水平上由于單個(gè)核苷酸位置上存在轉(zhuǎn)換（C與T轉(zhuǎn)換,在其互補(bǔ)鏈上則為G與A互換）或顛換（C與A,G與T,C與G,A與T互換）等變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP是人類可遺傳變異中最常見(jiàn)的一種,占所有已知變異的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在,平均每500～1000個(gè)堿基對(duì)中就有一個(gè),估計(jì)總數(shù)有300多萬(wàn)個(gè)?？傮w而言,SNP都是二等位多態(tài)性的,轉(zhuǎn)換的發(fā)生率總是明顯高于其他幾種變異,占其他變異的2/3,位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP（cDNA）比較少,在外顯子內(nèi)其變異率僅及周?chē)蛄?/5。不僅如此,SNP在基因組中的分布較微衛(wèi)星標(biāo)記廣泛的多,而且比微衛(wèi)星更穩(wěn)定,尤其是處在編碼區(qū)時(shí),另外還有易于規(guī)模化,自動(dòng)化分析的優(yōu)點(diǎn)。

4.2 在黔北麻羊育種中的應(yīng)用

SNP在黔北麻羊育種中的應(yīng)用還是比較廣泛的,任珍珍羅衛(wèi)星等（2010）[12]將生長(zhǎng)分化因子9（GDF9）基因和骨形態(tài)發(fā)生蛋白15（BMP15）基因作為候選基因,采用直接測(cè)序法檢測(cè)GDF9和BMP15基因在黔北麻羊中的單核苷酸多態(tài)性。羅衛(wèi)星等（2010）為了研究黔北麻羊GDF9基因多態(tài)性與產(chǎn)羔性能的關(guān)系,試采用直接測(cè)序法對(duì)黔北麻羊的生長(zhǎng)分化因子9（GDF9）基因外顯子2核苷酸多態(tài)性及其與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系進(jìn)行分析,結(jié)果表明,黔北麻羊群體GDF9基因外顯子2的959bp處存在A→C的堿基突變,導(dǎo)致編碼氨基酸由谷氨酰胺突變?yōu)楦彼帷?/p>

4.3 小結(jié)

SNP技術(shù)作為第3代分子遺傳標(biāo)記,在遺傳多樣性檢測(cè)、遺傳圖譜構(gòu)建、QTL定位、候選基因功能分析等方面具有重要作用。SNP技術(shù)為數(shù)量遺傳學(xué)提供了大量分子水平的信息,大大推進(jìn)了家畜育種的步伐。通過(guò)利用SNP技術(shù)進(jìn)行數(shù)量性狀主效基因的定位,充分了解動(dòng)物的經(jīng)濟(jì)性狀,促進(jìn)分子標(biāo)記輔助育種在生產(chǎn)上的應(yīng)用,從而推動(dòng)畜牧業(yè)快速有效地發(fā)展。在今后研究中,應(yīng)從已知的與重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的基因著手,研究這些基因外顯子、內(nèi)含子SNP多態(tài)性,特別是調(diào)控序列上的SNP多態(tài)性,這樣更容易找到與特定功能相關(guān)的分子標(biāo)記,提高家畜的選擇育種的效率。

5 展望

每種分子標(biāo)記技術(shù)都有其他傳統(tǒng)標(biāo)記無(wú)法比擬的優(yōu)越性。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展及基因組的測(cè)序完成,分子標(biāo)記技術(shù)將得到逐步改良和完善,達(dá)到更加準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、快捷檢測(cè)的目的,從而成為成熟的遺傳分析手段而更適于推廣應(yīng)用,越來(lái)越多的應(yīng)用于黔北麻羊的遺傳及應(yīng)用研究中。

[1]貴州省畜禽品種志編輯委員會(huì).貴州省畜禽品種志[M].貴陽(yáng):貴州科技出版社,1993:66-68.

[2]Mats Hansen,Christer Hallden,al.Marker-assisted selection of restored male-fertile Brassica napus plants using a set of dominant RAPD markers[J].Molecular Breeding,1997(3):449-456.

[3]Nienhuis J,Helentjaris T.RFLP analysis of loci.Associated with insect resistance in tomato[J].Crop Science,1987,27:797-803.

[4]賈永紅,史憲偉,簡(jiǎn)承松,等.貴州四個(gè)山羊品種mtDNA多態(tài)性及起源分化[J].動(dòng)物研究,1999,20(2):88-92.

[5]Williams J G K,Kubelik A R,Livak J L,ct a.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J].Nuckleic Acids Res,1990,18:6531-6535.

[6]楊家大,簡(jiǎn)承松,朱文適,等.黔湘渝4個(gè)山羊品種親緣關(guān)系的RAPD分析[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2002,30(1):14-17.

[7]Lynch M,Miligan B G.Analysis of population genetic structure with RAPD markers[J].Mol,1994(3):91-97.

[8]Perez T,Albornoz J,Dominguez A.An evaluation of RAPD fragment reproducibility and nature[J].Mol Ecol,1998(7):1347-1357.

[9]Ellsworth D l,Rittenhouse K D,Honeycutt R L.Artifactual variation in randomly amplified polymorphic DNA banding patterns[J].Bio-techniques,1993(14):214-217.

[10]毛鳳顯,皇甫江云,趙有璋.貴州地方山羊品種遺傳背景的微衛(wèi)星分析[J].畜牧獸醫(yī) 2006,38（1）:13-15.

[11]任珍珍,羅衛(wèi)星,蔡惠芬,等.黔北麻羊LHβ基因多態(tài)性及其與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性分析[J].山地農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2010,29（2）:135-138.

沈洪良（1986-），男，漢族，本科，獸醫(yī)師，主要從事獸醫(yī)、畜牧技術(shù)工作。