甘南牦牛源大腸桿菌的分離鑒定

董艷嬌，馬永生，楊麗艷，葉 泥（甘肅民族師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，合作 747000）

甘南牦牛源大腸桿菌的分離鑒定

董艷嬌，馬永生，楊麗艷，葉 泥
（甘肅民族師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，合作 747000）

大腸桿菌病是一種常見的人畜共患傳染病，其在甘肅甘南也有流行。為分離鑒定甘南牦牛源大腸桿菌并探究其致病性，采集甘南牦牛新鮮腹瀉糞便50份，進行營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)基分離純化和生化試驗鑒定。結(jié)果表明：27株分離株的形態(tài)染色、培養(yǎng)和生化特性符合大腸桿菌的特征；對分離株進行動物試驗，表明4株具有致病性。最后結(jié)合試驗結(jié)果和流行病學(xué)調(diào)查討論了牦牛大腸桿菌病存在的原因，并提出了相應(yīng)的防治措施，以期減少牦牛大腸桿菌的感染和流行。

牦牛；大腸桿菌；分離；鑒定

大腸桿菌是人和溫血動物腸道中正常的菌群成員之一，但在特定條件下其某些血清型可引起大腸桿菌病，且該病是一種常見的人畜共患傳染病。引起大腸桿菌病的致病性大腸桿菌主要有6個型，各種動物均可感染，以幼畜（禽）感染最為嚴(yán)重，導(dǎo)致其發(fā)生嚴(yán)重腹瀉和敗血癥，甚至死亡。該菌能通過患病動物的肉、乳及其排泄物和污染物傳播給人，引起腹瀉、出血性腸炎、溶血性尿毒綜合征等，嚴(yán)重者可致死［1］。

牦牛感染致病性大腸桿菌病主要以高熱、食欲減退、腸炎、消瘦為主要特征，嚴(yán)重時引起敗血癥和死亡，特別是犢牛；部分牛還出現(xiàn)呼吸困難、關(guān)節(jié)腫大、結(jié)膜潮紅；懷孕母牛流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)弱胎［2］。目前在印度、西藏、四川、青海等部分地區(qū)已有牦牛大腸桿菌病的研究，但甘南牦牛大腸桿菌病的研究尚未見報道。牦牛是甘南群眾不可缺少的生產(chǎn)、生活資料，存欄數(shù)87萬頭以上，占全州牲畜的30%左右，占全省牦牛的85.19%［3］。大腸桿菌病為甘南牦牛常見多發(fā)病，是造成牦牛腹瀉的主要原因之一，且具有較高的發(fā)病率，其不僅直接降低牦牛的生產(chǎn)性能和畜產(chǎn)品的質(zhì)量，還對畜牧業(yè)經(jīng)濟發(fā)展和公共衛(wèi)生安全帶來隱患。因此，筆者等進行甘南牦牛源大腸桿菌的分離鑒定，以期為大腸桿菌病的監(jiān)測、防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

采集于甘南地區(qū)牦牛新鮮腹瀉糞便50份。

1.2 實驗動物

清潔小白鼠，購自甘肅天鴻元有限公司。

1.3 主要耗材

微量生化管購自杭州微生物試劑有限公司，營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、麥康凱、伊紅美藍、SS瓊脂、三糖鐵斜面、明膠液化等培養(yǎng)基和二乙酰、甲基紅、枸櫞酸鈉、吲哚及革蘭氏染液等試劑均自行配制。

1.4 大腸桿菌的分離純化

1.4.1 培養(yǎng)基及試劑的配制 培養(yǎng)基及試劑均參考文獻［4］配制。

1.4.2 稀釋檢樣 稱取1 g牦牛新鮮腹瀉糞樣，依次制成10-1、10-2、10-3的稀釋液。

1.4.3 細菌的培養(yǎng)分離 將稀釋檢樣分別接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，涂布均勻，并做平行及對照，37℃培養(yǎng)24 h，挑取疑似單個菌落于玻片上，進行革蘭氏染色并鏡檢。

1.4.4 大腸桿菌的純化 挑取疑似單個菌落，接種于麥康凱培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，選取紅色菌落接種于伊紅美藍培養(yǎng)基上，相似條件培養(yǎng)，挑取黑色菌落到麥康凱培養(yǎng)基中繼續(xù)純化。最后接種于SS瓊脂培養(yǎng)基，觀察培養(yǎng)結(jié)果。

1.5 大腸桿菌的生化鑒定

用接種環(huán)挑取純化好的菌落分別接種到三糖鐵斜面培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、乳糖、葡萄糖、甘露糖、枸櫞酸鹽、蔗糖、麥芽糖、山梨醇、木糖、L-鼠李糖、氧化酶、微量生化管、蛋白胨溶液、葡萄糖蛋白胨溶液、葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中培養(yǎng)，具體操作及結(jié)果判定參照文獻［4］。

1.6 動物致病性試驗

1.6.1 大腸桿菌懸浮液的制備 將純化好的菌落接種于5mL的普通肉湯培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)5 h，菌液分裝于離心管中，2 500 r/min離心10min，去上清液，用生理鹽水吹打離心，去上清液，重復(fù)一次，然后加入2mL的生理鹽水，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 動物致病性試驗 將試驗小鼠隨機分組，每組2只，除一組腹腔注射0.2mL營養(yǎng)肉湯作為對照，其余均注射0.2mL菌懸液。隔離飼養(yǎng)1周，連續(xù)觀察小鼠的臨床癥狀，并對死亡小鼠進行解剖，記錄病變，后取少許病料做回歸鑒定。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)特性及形態(tài)特征

挑取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上形成凸起、表面光滑、半透明、乳白色、中等大小的菌落，革蘭氏染色鏡檢可見短粗、兩端鈍圓、多數(shù)單個存在，少數(shù)成雙排列的陰性紅色短桿菌；將其接種到麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上可見扁平、邊緣整齊、表面光滑的紅色菌落。將紅色菌落接種到伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上可見黑色帶有金屬光澤的菌落，將黑色菌落再次接種到麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上二次純化后接種SS瓊脂培養(yǎng)基，細菌不生長或生長不良。經(jīng)以上分離純化，確定27株分離菌符合大腸桿菌的培養(yǎng)和形態(tài)特征。

2.2 生化鑒定結(jié)果

純化的27株分離菌均能發(fā)酵葡萄糖、甘露糖、乳糖、麥芽糖且產(chǎn)氣，41%發(fā)酵蔗糖個別產(chǎn)氣，88.9%發(fā)酵山梨醇，85.1%發(fā)酵木糖和L-鼠李糖，92.6%的菌株吲哚反應(yīng)陽性，74.0%菌株甲基紅反應(yīng)陽性，二乙酰試驗、枸櫞酸鹽、氧化酶、明膠液化反應(yīng)均為陰性。綜合培養(yǎng)、形態(tài)和生化鑒定結(jié)果，27株分離株基本符合大腸桿菌的特征，分離率54%。

2.3 動物試驗

將分離菌株的菌懸液接種54只小鼠后，12 h開始發(fā)病，35只小白鼠表現(xiàn)行動緩慢、精神萎靡、被毛粗亂豎起、發(fā)抖、飲食量減少、肛門周圍粘有黃色腹瀉糞便。24 h開始死亡1只，至48 h共死亡4只。對死亡小鼠進行解剖，表現(xiàn)敗血癥和腸炎，發(fā)現(xiàn)其胸腔有積液，腸腫脹部分發(fā)黑或呈土黃色，肝臟、腎臟、肺臟為黑紅色并伴有出血點，心臟有黑點。取其心、肝、肺、腎、腸黏膜上的微量血液或部分結(jié)構(gòu)研磨進行鏡檢、分離培養(yǎng)，均可見大腸桿菌。72 h內(nèi)未死亡的小鼠行動逐漸敏捷、食欲增加，1周后剖檢，未見病變。對照組小鼠在整個試驗過程中未見異常。結(jié)果表明，27株分離菌中有4株具致病性，小鼠發(fā)病率64.8%，死亡率7.4%，致病菌的分離率8%。因此，致病性大腸桿菌在牦牛腹瀉糞便的分離率較高，是引起甘南牦牛腹瀉的病因之一。

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查顯示，甘南牦牛大腸桿菌病多呈散發(fā)性或地方流行性，無明顯的季節(jié)性，以冬春季節(jié)易多發(fā)，該病以1～4月齡的犢牦牛最易感，其次是母牦牛，公牦牛感染少，多呈隱性經(jīng)過。該病的發(fā)病率和死亡率分別為8%和2%，既是原發(fā)性疾病，又可繼發(fā)多種疾病，如大腸桿菌感染可以繼發(fā)牛乳腺炎，對牛乳的產(chǎn)量、質(zhì)量及乳汁凝固都有一定的影響［5］。

3.1 大腸桿菌病的致病機理及在當(dāng)?shù)仄毡榇嬖诘脑蚍治?/p>

致病性大腸桿菌經(jīng)由污染的飼料、飼草、飲水及患畜的乳、肉等進入宿主的消化道或呼吸道，其通過粘附素、定居因子等粘附和定居在宿主呼吸道和消化道黏膜上，通過侵襲因子、腸毒素、類志賀毒素、Vero毒素、強毒力島、鐵獲得系統(tǒng)等毒力破壞宿主免疫系統(tǒng)的功能，從而在體內(nèi)生長繁殖，增強其毒力而致?。?-7］。其外膜蛋白F結(jié)構(gòu)和產(chǎn)生的生物膜、質(zhì)粒等也利于大腸桿菌的生存，逃避抗生素藥物的作用［8-10］。由于甘南農(nóng)牧民牦牛養(yǎng)殖飼養(yǎng)管理方式傳統(tǒng)粗放，疫病防治意識薄弱，防疫條件力量有限，加之受當(dāng)?shù)靥厥獾臍夂颦h(huán)境、應(yīng)激因素和抗生素濫用等原因誘發(fā)了大腸桿菌的強致病機能，使得大腸桿菌病在甘南普遍存在。

3.2 大腸桿菌病的防治措施與建議

（1）加強飼養(yǎng)管理。注意飼料營養(yǎng)配比均衡，進行適當(dāng)補飼，補充維生素和微量元素等以提高機體抵抗力；搞好牦牛圈舍的清潔及環(huán)境衛(wèi)生工作，定期消毒；注重檢疫，對有腹瀉癥狀的病畜隔離治療；避免過度驚嚇、勞役、驅(qū)趕等減少牦牛應(yīng)激因素，降低誘發(fā)因素，防止大腸桿菌的交叉及垂直感染，減少牦牛大腸桿菌病的傳播。

（2）建立長期的疫病監(jiān)測機制，明確甘南牦牛大腸桿菌病原血清型，篩選本地流行的優(yōu)勢血清型制作大腸桿菌滅活苗，制定合理的免疫程序進行預(yù)防接種，增強機體抵抗力。同時，加大新型疫苗的開發(fā)，如efa-1'的DNA疫苗、肽疫苗、殼聚糖納米粒子、重組大腸桿菌志賀菌素、新型疫苗抗原組合等。已有的研究表明，上述新型疫苗對預(yù)防大腸桿菌病有一定的潛在作用［11-15］。

（3）研究致病性大腸桿菌病原血清型的相關(guān)毒力因子、基因結(jié)構(gòu)和代謝等，了解其具體的致病機制，以探索研究降低其毒力的措施。

（4）研究新型藥物或新型治療劑，控制抗生素的使用，避免耐藥性的產(chǎn)生。開發(fā)中草藥配伍制劑，如黃芩、黃芪、石菖蒲、陳皮、甘草、蒼術(shù)等中草藥提取物的合劑［16］，同時嘗試紅景天、藏木香、柴胡、翼首草、蟲草等藏藥制劑的開發(fā)；此外，有資料顯示，MJ1噬菌體可抑制細菌的增殖，異硫氰酸酯可影響大腸桿菌的細胞和毒力形成，405 nm紫色光可抗β-內(nèi)酰胺抗性大腸桿菌，NO能降低大腸桿菌持久復(fù)發(fā)性感染的發(fā)生率，對這些藥物或治療劑進行充分研究，可發(fā)揮其預(yù)防和控制大腸桿菌的潛在性能［17-20］。

（5）加大動物微生態(tài)制劑的開發(fā)與研究。丁酸梭菌、人源型乳酸桿菌干酪乳桿菌和多粘類芽孢桿菌等一種或混合益生菌添加劑均可抑制致病性大腸桿菌［21-23］。也可通過添加血漿免疫球蛋白和抗菌肽，減少腹瀉性疾病的發(fā)生和提高抵抗力［24-25］。

4 結(jié)論

綜上表明，甘南牦牛存在致病性大腸桿菌感染。因此，要充分研究牦牛源性大腸桿菌的致病性及其與宿主、環(huán)境之間的相互作用，做好該病的流行病學(xué)調(diào)查、疫情監(jiān)測和疫病防治等相關(guān)工作，以更好地控制疫病，減少其流行和蔓延。

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《中國草食動物科學(xué)》期刊采編系統(tǒng)正式上線運行

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Isolation and Identification of Escherichia coli from Gannan Yak

DongYanjiao，Ma Yongsheng，Yang Liyan，et al
（Department of Chemistry and Life Science，Gansu Normal University for Nationalities，Hezuo 747000，China）

yak；Escherichia coli；isolation；identification

S858.23

A

2095-3887（2017）01-0040-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.01.012

2016-12-06

甘肅省教育廳高等學(xué)?？茖W(xué)研究項目（2015A-155）；甘肅民族師范學(xué)院校長科研基金項目（14-15）

董艷嬌（1982-），女，講師，碩士，主要從事動物疫病研究。

Abstrace：Colibacillosis is a common zoonotic infectious disease which is epidemic in Gannan. In order to separate Escherichia coli from Gannan yak and explore its pathogenicity，50 samples of fresh diarrhea feces from yak were cultured by nutrient agar medium，isolated and purified by selective medium，identificated by biochemical tests.The morphology strain，culture and biochemical characteristics of 27 strains were consistent with E.coli and four strains were pathogenic by animal tests.At last，to analysis the cause of the Colibacillosis combined with experimental results and epidemiological investigation，the prevention and treatment measures for reducing the infection and epidemic of E. coli in yak were put forward.