外源NO對(duì)干旱脅迫下茶樹(shù)生理特性的影響

曹 丹，金孝芳，馬林龍，劉艷麗

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)茶葉研究所，湖北 武漢 430064）

外源NO對(duì)干旱脅迫下茶樹(shù)生理特性的影響

曹 丹，金孝芳＊，馬林龍，劉艷麗

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)茶葉研究所，湖北 武漢 430064）

研究外源NO對(duì)干旱脅迫生理生化反應(yīng)。以15%聚乙二醇 （PEG 6000）模擬干旱脅迫，0．5 mmol·L－1的外源NO供體 （SNP）處理對(duì)茶樹(shù)幼苗葉片游離脯氨酸、丙二醛 （MDA）的含量及保護(hù)酶活性的影響。結(jié)果表明，一定濃度的SNP緩解干旱脅迫傷害的效果較好，顯著提高了受干旱脅迫茶樹(shù)幼苗葉片的保護(hù)酶 （CAT）活性和游離脯氨酸含量，并降低了MDA的含量。表明外源NO通過(guò)提高干旱脅迫下滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和保護(hù)酶活性，降低MDA的含量，緩解干旱脅迫對(duì)茶樹(shù)幼苗的損傷，增強(qiáng)植株的抗旱性。

一氧化氮；干旱脅迫；茶樹(shù)幼苗；氧化損傷

茶樹(shù)［Camellias sinensis（L．）O．Kuntze］屬于山茶科山茶屬多年生常綠木本植物，性喜濕潤(rùn)。我國(guó)茶區(qū)分布廣泛，部分茶區(qū)四季分明，雨量和太陽(yáng)輻射能周年分布不均，6月至9月常發(fā)生高溫少雨、日照強(qiáng)烈的情況，故許多茶區(qū)都會(huì)先后出現(xiàn)不同程度的伏旱和秋旱。據(jù)報(bào)道，2006年因持續(xù)連晴高溫天氣，重慶市萬(wàn)盛區(qū)666．67hm2的茶園受損嚴(yán)重，其中約133．33hm2茶園的近720萬(wàn)株茶樹(shù)因旱害死亡［1］。2013年7～8月的高溫干旱，導(dǎo)致浙江省輕度、中度、重度受害茶園面積分別達(dá)7、4．92和1．94萬(wàn)hm2，其中重度受害中絕收死亡茶園面積達(dá)5070hm2，占受害茶園的3．66%，嚴(yán)重影響了夏秋茶的生產(chǎn)以及翌年春茶的產(chǎn)量［2］。故研究茶樹(shù)抗旱機(jī)制對(duì)提高茶樹(shù)的抗旱性，以及對(duì)茶樹(shù)耐旱優(yōu)良新品種的選育都有著非常重要的意義。

一氧化氮（nitric oxide，NO）是植物體內(nèi)重要的生物活性分子，主要由一氧化氮合酶和硝酸還原酶催化形成。研究表明，NO參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)生理過(guò)程，比如種子萌發(fā)、根生長(zhǎng)、葉擴(kuò)展、細(xì)胞凋亡以及植物的耐逆反應(yīng)［3］。目前，已有研究表明NO可以緩解由于熱激、低溫脅迫及鹽脅迫等對(duì)植物造成的傷害。但NO對(duì)于干旱脅迫下茶樹(shù)幼苗的生理特性的研究還未見(jiàn)報(bào)道，本文研究外源NO對(duì)PEG 6000模擬的中度干旱脅迫下茶樹(shù)幼苗的游離脯氨酸 （Pro）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量以及過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）活性的影響，探究外源NO對(duì)提高茶樹(shù)抗旱性的作用，為闡明NO提高植物抗旱性的機(jī)理研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

供試材料為湖北省茶樹(shù)種質(zhì)資源圃培育的1年生茶樹(shù)扦插苗，品種為鄂茶1號(hào)。

1．2 試驗(yàn)方法

選擇長(zhǎng)勢(shì)均勻的1年生茶樹(shù)扦插苗移栽到塑料小桶，每桶5株，共12桶，用清水進(jìn)行水培適應(yīng)，7d（確保扦插苗成活）后進(jìn)行干旱脅迫，將茶苗隨機(jī)分成3組。其中一組用清水培養(yǎng)作為對(duì)照組（CK），其余組用15%聚乙二醇（PEG 6000）溶液模擬干旱脅迫。采用小型噴霧器分別對(duì)PEG溶液培養(yǎng)的茶樹(shù)葉面噴施濃度為0、0．5mmol·L－1的硝普鈉 （SNP）溶液，對(duì)照組噴施清水，以葉片布滿液滴且無(wú)下滴為宜［4－5］，葉面噴施SNP后立即進(jìn)行PEG脅迫處理。PEG處理后分別在2h，4 h，6h，8h，10h采樣（一芽三葉），葉片用蒸餾水沖洗，濾紙吸干表面水分后置－80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 測(cè)定指標(biāo)

過(guò)氧化氫酶 （CAT）活性、總超氧化物酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量分別采用過(guò)氧化氫 （CAT）測(cè)定試劑盒 （可見(jiàn)光法）、總超氧化物歧化酶 （T－SOD）測(cè)試盒 （羥胺法）、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒（TBA法）進(jìn)行測(cè)定（所用試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所），游離脯氨酸 （Pro）含量采用參照賈根良［6］的實(shí)驗(yàn)方法。

1．4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用PASW Statistics 18．0統(tǒng)計(jì)軟件，應(yīng)用單因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用最小顯著差法（LSD），p＜0．05，認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2．1 外源NO對(duì)干旱脅迫下茶樹(shù)葉片游離脯氨酸含量的影響

由圖1可知，與對(duì)照組相比，干旱脅迫處理隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，茶樹(shù)葉片中游離脯氨酸含量不斷增加，增幅為31%～80%（p＜0．05）；干旱加外源NO處理的茶樹(shù)葉片中游離脯氨酸含量均明顯高于干旱脅迫組，增幅為23%～36%（p＜0．05），說(shuō)明外源NO顯著提高了干旱脅迫下茶樹(shù)葉內(nèi)的游離脯氨酸含量。

圖1 NO對(duì)干旱脅迫下茶樹(shù)葉片游離脯氨酸含量的影響Fig．1 Effect of NO on free proline in tea leaves under drought stress

2．2 外源NO對(duì)干旱脅迫下茶樹(shù)葉片MDA含量的影響

如圖2所示，與對(duì)照組相比，干旱脅迫組茶樹(shù)葉片中MDA含量顯著增加，其增幅為85%～312%（p＜0．05）；與干旱脅迫組相比，干旱加外源NO處理的MDA含量減少17%～52%（p＜0．05），其中8h時(shí)無(wú)明顯差異，說(shuō)明外源NO處理能降低干旱脅迫下茶樹(shù)葉內(nèi)的MDA含量。

圖2 NO對(duì)干旱脅迫下茶樹(shù)葉片MDA含量的影響Fig．2 Effect of NO on free MDA in tea leaves under drought stress

2．3 外源NO對(duì)干旱脅迫下茶樹(shù)葉片抗氧化酶活性的影響

如圖3和圖4可知，在干旱脅迫處理下CAT和SOD的活性增加，但增量程度不同，干旱處理分別比對(duì)照增加52%～243%、1%～5%，其中10 h時(shí)，二者均比對(duì)照組低，這可能是因?yàn)樵诟珊得{迫下氧化酶活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)；干旱加外源NO處理則分別比干旱處理增加23%～167%（p ＜0．05）、3%～6%，說(shuō)明外源NO處理可以顯著提高CAT的活性，以減輕干旱脅迫對(duì)茶樹(shù)的傷害。

圖3 NO對(duì)干旱脅迫下茶樹(shù)葉片CAT活性的影響Fig．3 Effect of NO on CAT activity in tea leaves under drought stress

圖4 NO對(duì)干旱脅迫下茶樹(shù)葉片SOD活性的影響Fig．4 Effect of NO on SOD activity in tea leaves under drought stress

3 討論

植物葉片的形態(tài)和生理的變化可以反映其受干旱等逆境脅迫的程度［7－8］。在干旱脅迫處理過(guò)程中，通過(guò)對(duì)植株葉片進(jìn)行形態(tài)觀察、脯氨酸和MDA含量等的測(cè)定，確保了干旱脅迫處理合理可靠。本研究顯示，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，Pro和MDA含量顯著增加，抗氧化酶CAT和SOD活性也增強(qiáng)，這說(shuō)明干旱脅迫持續(xù)時(shí)間影響了茶樹(shù)對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)；本研究還發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫不同階段茶樹(shù)具有不同的形態(tài)及生理響應(yīng)特征。

脯氨酸是植物在逆境下最為有效的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，具有穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)、維持水分、降低細(xì)胞酸性、降低滲透壓、防止植物脫水、解除毒氨以及提供代謝能源及合成蛋白質(zhì)的碳源和氮源［9］；脯氨酸在一定程度上反映了植物的抗逆性，故植物在受到干旱脅迫時(shí)，其含量的增加有利于防止植物脫水，保持細(xì)胞水分，緩解細(xì)胞酸化，提供代謝能源及蛋白質(zhì)合成的原料［10－12］。本試驗(yàn)表明，茶樹(shù)葉片脯氨酸的含量隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，這與楊華［1］，劉玉英等［13］的研究結(jié)果基本一致；外源NO提高了干旱脅迫下茶樹(shù)幼苗體內(nèi)脯氨酸的含量，減輕了干旱對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的傷害。這可能與NO可提高谷氨酰激酶底物γ－谷氨酰磷酸合成活力有關(guān)，γ－谷氨酰磷酸與脯氨酸累積成正相關(guān)［14］。植物細(xì)胞可以通過(guò)多種途徑產(chǎn)生H2O2等活性氧，和H2O2又可進(jìn)一步發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成毒性更強(qiáng)的羥基自由基 （OH），該自由基可將脂肪酸氧化成有毒的過(guò)氧化物，破壞生物膜，導(dǎo)致MDA累積。當(dāng)環(huán)境遭到脅迫時(shí)，植物會(huì)發(fā)生質(zhì)膜過(guò)氧化，其終產(chǎn)物MDA可與細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)、酶等物質(zhì)結(jié)合或交聯(lián)而使之失活，進(jìn)而破壞生物膜的結(jié)構(gòu)與功能［15－16］，MDA含量可作為反映細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用和質(zhì)膜損傷程度的重要指標(biāo)［17－18］。在本試驗(yàn)中，干旱加外源NO處理的茶樹(shù)葉片MDA的含量低于干旱脅迫組，說(shuō)明外源NO抑制了干旱脅迫下茶樹(shù)葉片膜脂化氧化損傷，提高了茶樹(shù)的抗旱性。

逆境脅迫可引起植物細(xì)胞活性氧 （ROS）急劇增加，過(guò)量的活性氧能導(dǎo)致蛋白質(zhì)、DNA以及脂類的氧化損害，并最終引發(fā)細(xì)胞死亡［19］。抗氧化酶系統(tǒng)的協(xié)調(diào)作用可清除過(guò)剩的氧自由基，防止細(xì)胞受到損傷［20－21］。CAT可以分解逆境脅迫中產(chǎn)生的H2O2，從而減少干旱脅迫對(duì)植物細(xì)胞的損傷［2］。SOD對(duì)清除生物體內(nèi)的超氧離子基團(tuán)、防御活性氧及其它氧化物自由基對(duì)細(xì)胞膜的傷害具有重要的作用。本研究中，在干旱脅迫下，外源NO處理可顯著提高茶樹(shù)葉片的CAT活性，這可能是由于NO作為信號(hào)分子調(diào)控抗氧化酶基因的表達(dá)［］。

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Effect of Exogenous Nitric Oxide on Physiological Characteristics of Tea Plants under Drought Stress

CAO Dan，JIN Xiao－fang＊，MA Lin－long，LIU Yan－li
（Fruit and Tea Research Institute，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan，Hubei 430064，China）

Physiological and biochemical responses of tea plants to drought stress by addition of nitric oxide（NO）in soil were studied．Under a simulated drought stress by adding 15%PEG 6000to the soil，the effects of 0．5mmol· L－1SNP on the activities of protective enzymes as well as the contents of free proline and MDA in the leaves of the tea seedlings were determined．The results showed that，with the NO addition，the activity of CAT and content of free proline in leaves increased significantly，while MDA decreased．It suggested that the exogenous NO enhanced the tolerance of the tea seedlings to drought via an increase in enzymatic activity，the osmotic adjustment by added substances，and a reduction on MDA．

NO；drought stress；tea seedling；oxidative damage

S571．1；Q945．78

：A

：2096－0220（2016）02－0076－03

2016－03－25初稿；2016－05－25修改稿

湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心項(xiàng)目（2016－620－000－001－032）；湖北省農(nóng)科院青年科學(xué)基金（2016NKYJJ24）。

曹丹（1988－），女，碩士，主要從事茶樹(shù)逆境生理、茶樹(shù)資源與育種研究。E－mail：skyiswide＠163．com

＊通訊作者：金孝芳（1982－），男，助理研究員，主要從事茶樹(shù)種質(zhì)資源與遺傳育種研究。E－mail：jxf1130＠126．com