聚合酶鏈反應(yīng)檢測麻風(fēng)分枝桿菌的研究進展

劉 敏 郝明巨

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聚合酶鏈反應(yīng)檢測麻風(fēng)分枝桿菌的研究進展

劉 敏1郝明巨2

麻風(fēng)的早期診治對減少疾病傳播、預(yù)防疾病進展和致殘起重要作用。本文對PCR技術(shù)在檢測麻風(fēng)桿菌中的應(yīng)用作一綜述。

麻風(fēng)； 麻風(fēng)分枝桿菌； 聚合酶鏈反應(yīng)

麻風(fēng)桿菌在體外尚不能培養(yǎng)，常用的檢測麻風(fēng)菌的實驗室方法是皮膚組織液刮片抗酸染色法(AFB)。AFB染色的方法敏感度很低，需要每克組織中至少含有104個細菌才能在顯微鏡下觀察到[1]。PCR是一種高度敏感和特異的檢測樣本細菌DNA的方法，在過去30年里，已開發(fā)了多種用于麻風(fēng)桿菌DNA的PCR檢測方法，這些方法的應(yīng)用對麻風(fēng)的早期診治和預(yù)防有重要意義。

1 PCR技術(shù)檢測麻風(fēng)分枝桿菌的實驗室方法學(xué)研究進展

1.1 方法學(xué)進展 1989年，Hartskeerl等通過基因提取、擴增、識別等過程，檢測麻風(fēng)36kDa抗原編碼基因，發(fā)現(xiàn)具有很高的靈敏度和特異性[2]。1990年，Williams等[3]基于探針雜交技術(shù)建立了一套檢測感染樣本中麻風(fēng)菌DNA的PCR方法。同年，Plikaytis等運用巢式PCR的方法，采用兩步法擴增麻風(fēng)菌DNA片段，將靈敏度提高到了單個菌體的水平，縮短了檢測時間[4]。單管PCR方法的運用避免了二次擴增的污染，簡化了操作流程，而且提高了實驗的靈敏度。2001年，Cole等[5]首先完成了麻風(fēng)菌的全基因組測序，之后麻風(fēng)菌的PCR檢測得到了迅猛發(fā)展。實時定量PCR技術(shù)的應(yīng)用，明顯提高了檢測的敏感度和特異性，大大縮短了檢測時間，而且能夠?qū)毦鶧NA進行直接定量，評估病人體內(nèi)的細菌指數(shù)[6，7]。

1.2 檢測的DNA目標(biāo)片段 能夠作為麻風(fēng)菌DNA序列PCR擴增的靶基因有很多，包括18kDa、36kDa、65kDa等蛋白編碼基因[4，8]、85抗原復(fù)合體(Ag85)基因[6]、sodA和16SrRNA[7]、多拷貝重復(fù)序列(RLEP)[9]、TTC重復(fù)序列[10]、HSP18 mRNA等[11]。由于重復(fù)序列存在于基因組DNA的多個部位，因此選擇重復(fù)序列作為PCR的靶向DNA能夠提高靈敏度，RLEP能夠檢測出10 fg含量的麻風(fēng)菌DNA[12]。Martinez等運用定量PCR的方法比較了sodA、16SrRNA、RLEP和Ag85B對麻風(fēng)的診斷價值，發(fā)現(xiàn)幾種序列的特異性沒有顯著性差異，Ag85B、16SrRNA、sodA敏感度分別為66.1%、62.9%、59.7%，而RLEP敏感度最高為87.1%[13]。

Turankar等[14]對麻風(fēng)病人的皮膚組織液切刮涂片、血液和病人周圍環(huán)境中的土壤標(biāo)本運用PCR的方法進行檢測，比較了RLEP、rpoT、SodA和16SrRNA基因的敏感度的差異，同樣發(fā)現(xiàn)RLEP基因的敏感度是最高的，分別能夠檢測出83%的皮膚切刮涂片標(biāo)本、36%的土壤樣本和所有血液陽性的標(biāo)本，而且，在細菌指數(shù)BI陰性的麻風(fēng)病人血液樣本中仍有53%的陽性率。需要注意的是，RLEP基因高度保守，在其它分枝桿菌屬也存在許多的同源序列，容易使實驗結(jié)果出現(xiàn)假陽性[15]。最近的一項研究以麻風(fēng)菌的4α萄聚糖轉(zhuǎn)移酶基因(ML1545)作為靶點，與RLEP相比，具有非常高的靈敏度和特異性[16]。

1.3 檢測樣本類型 PCR不僅可以檢測皮膚活檢標(biāo)本，還可以用于檢測皮膚組織液切刮涂片、尿液、口腔和鼻腔拭子、毛囊、鼻腔分泌物、淋巴和血液等樣本的檢測[11，17-21]。皮膚活檢樣本可以預(yù)先經(jīng)過石蠟包埋、福爾馬林固定等處理后進行PCR檢測，也可以將樣本貯存于70%乙醇和FTA?洗脫卡中，甚至經(jīng)過抗酸染色的推片也能夠用于麻風(fēng)的分子診斷[22-24]。這些標(biāo)本非常利于樣本的貯存和轉(zhuǎn)運，便于樣本的回顧性分析和轉(zhuǎn)運至參考實驗室進行診斷的確認(rèn)。非侵入性標(biāo)本在臨床上易于獲得，方便取材，對患者的創(chuàng)傷小，給麻風(fēng)菌的檢測帶來便利，應(yīng)用前景廣闊，但目前來看，皮膚活檢仍是一種應(yīng)用最廣泛和陽性檢出率最高的樣本。

近幾年，有學(xué)者[14，25]在麻風(fēng)高流行區(qū)開展麻風(fēng)分子流行病學(xué)研究中，對麻風(fēng)菌污染的土壤和水源進行了檢測，檢測到了麻風(fēng)菌的DNA，為麻風(fēng)流行病學(xué)傳播提供了依據(jù)。

2 PCR技術(shù)檢測麻風(fēng)的臨床應(yīng)用

2.1 用于少菌型麻風(fēng)的診斷 少菌型麻風(fēng)由于皮損中麻風(fēng)菌含量較少，臨床上診斷較為困難。Martinez等通過PCR方法在79.2%的常規(guī)麻風(fēng)菌檢查為陰性的患者皮損中檢測出麻風(fēng)桿菌[6]，RLEP能夠檢測出73%的麻風(fēng)菌指數(shù)(BI)為0的麻風(fēng)病患者皮損內(nèi)的麻風(fēng)菌[13]。國內(nèi)研究者運用RT-PCR的方法檢測51例PB病人，38例呈陽性，敏感度達到了8 fg。一項回顧性研究中，檢測了一組既往診斷為皮膚病的麻風(fēng)菌的不同基因(Ag85B、sodA、16S rRNA和RLEP)[7]，當(dāng)包含大量少菌樣本(單一皮損和結(jié)核樣型麻風(fēng))時，雖然敏感度有所下降，但仍有50%。由此可見，PCR反應(yīng)的高靈敏度和特異性非常有助于早期麻風(fēng)或少菌型麻風(fēng)的診斷。

2.2 用于單純神經(jīng)炎性麻風(fēng)(PNL)的診斷 PNL表現(xiàn)為皮膚麻痹或感覺喪失，皮損區(qū)域內(nèi)神經(jīng)腫大，但無肉眼可見的皮損。病人往往鏡檢和組織學(xué)檢查陰性，沒有典型的皮膚損害，很容易被漏診。Bezerra等研究者通過PCR的方法發(fā)現(xiàn)，約1/3神經(jīng)活檢抗酸染色檢查陰性的PNL病人，能夠檢測到麻風(fēng)菌[26]。Jardim等證實，PCR對于PNL病例的診斷優(yōu)于抗PGL-I抗體和抗酸染色鏡檢[27]，因此，PCR為PNL提供了一種高靈敏度的診斷方法。

2.3 用于麻風(fēng)的治療監(jiān)測 PCR不僅用于麻風(fēng)的診斷，而且能夠評估病菌載量，有助于疾病的治療監(jiān)測。Santos等[21]利用RLEP法PCR檢測了麻風(fēng)病人的毛發(fā)球囊，血清、鼻腔分泌物、淋巴和皮膚活檢樣本，發(fā)現(xiàn)在MDT治療長達8年以后，以上臨床樣本中，至少有一項PCR檢測為陽性的病人所占的比例仍有54.5%。因此，這種基于DNA的PCR分析容易引起“臨床假陽性”，不能真實的反應(yīng)治療效果。鑒于此，一些研究通過逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)來評估麻風(fēng)菌載量?；趯Υ砘罹鷺?biāo)志的16S rRNA的基因表達分析，溫艷等[28]運用RT-PCR方法擴增14例麻風(fēng)患者治療前、中、后皮損組織麻風(fēng)菌16S rRNA，發(fā)現(xiàn)麻風(fēng)活菌量隨治療時間的延長也隨之下降。然而，Phetsuksiri等[29]發(fā)現(xiàn)在MDT治療6個月后，雖然PB病人的陽性率下降為4%，仍有44%的多菌型(MB)病人能夠檢測到16S rRNA。

由于16S rRNA相對穩(wěn)定，同時也是一種管家基因，缺乏靶基因來對模板進行標(biāo)準(zhǔn)化以用于麻風(fēng)菌定量檢測，為解決上述問題，Martinez等[7]提出一項基于RNA/DNA比值的實時定量PCR技術(shù)，利用麻風(fēng)菌特異性RNA相對于總DNA的降低以評估治療效果。體外實驗表明，在利福平作用后的48小時就有比值的降低，病人活檢樣本證實了MDT治療與基因表達水平的相關(guān)性，這種方法可以對麻風(fēng)病人治療和耐藥監(jiān)測進行隨訪[30]。Lini等[11]分別檢測麻風(fēng)菌DNA和HSP 18mRNA來觀察麻風(fēng)療效，他們檢測了47例麻風(fēng)患者中石蠟包埋樣本中麻風(fēng)菌DNA和mRNA拷貝數(shù)，在經(jīng)歷了2年的MDT治療后，雖然仍能在皮損部位檢測到麻風(fēng)菌DNA，但已經(jīng)檢測不到HSP18mRNA。由此可見，基于RNA的PCR檢測也有助于評價麻風(fēng)治療效果。

2.4 用于麻風(fēng)菌耐藥基因的檢測 麻風(fēng)菌耐藥對麻風(fēng)化學(xué)治療帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，對利福平耐藥菌株是由編碼細菌RNA聚合酶β亞單位的rpoB基因發(fā)生突變所致。2001年，Honoré等[31]通過PCR擴增和一系列寡核苷酸探針進行雜交，檢測出對利福平(RFP)耐藥麻風(fēng)菌株。王紅斌等利用Q-solution作為PCR反應(yīng)增效劑，巢式PCR提高PCR敏感性，快速、高效地擴增出RFP耐藥的rpoB基因片段，再通過測序檢測出麻風(fēng)菌對RFP的耐藥基因[32]。除了能夠檢測出對利福平耐藥的rpoB基因突變，有研究者利用PCR擴增后對基因產(chǎn)物進行測序或者一種新的“實時定量PCR-高分辨熔解分析(RT-PCR-HRM)”技術(shù)，能夠檢測出對氨苯砜和氧氟沙星等喹諾酮類藥物耐藥分別相關(guān)的folP1、gyrA基因突變[33,34]。因此，PCR對于檢測麻風(fēng)桿菌耐藥基因，進而選擇合適的抗菌藥物，對病人進行個體化治療發(fā)揮不可替代的作用。

2.5 用于麻風(fēng)密切接觸者的發(fā)病監(jiān)測 對家庭密切接觸者的監(jiān)測和隨訪是防控麻風(fēng)的重要環(huán)節(jié)，通過PCR技術(shù)能夠早期發(fā)現(xiàn)麻風(fēng)菌的感染。麻風(fēng)菌主要通過飛沫傳播，因此許多研究以鼻腔拭子作為樣本，通過PCR方法檢測家庭接觸者的麻風(fēng)菌DNA。值得注意的是，大約1%～10%的家庭密切接觸者鼻腔拭子中能檢測出麻風(fēng)菌DNA，但是并不代表這些陽性個體最終會發(fā)病[35]，如此高的陽性率對PCR監(jiān)測密切人群帶來疑問。有研究顯示PGL-I試驗陽性的密切接觸者發(fā)病的風(fēng)險較大[36]，因此有研究者建議將PCR與PGL-I聯(lián)合測定用于識別家庭密切者的亞臨床感染，提前用藥進行預(yù)防[37]。PCR對于監(jiān)測麻風(fēng)密切接觸者的意義值得進一步研究。

2.6 用于麻風(fēng)流行病學(xué)傳播的研究 環(huán)境因素對于麻風(fēng)菌的傳播得到越來越多的重視。利用PCR檢測麻風(fēng)菌污染的土壤和水源有助于分析傳染源，為麻風(fēng)流行病學(xué)傳播提供依據(jù)。Lavania等采用PCR擴增麻風(fēng)菌16S rRNA發(fā)現(xiàn)，在麻風(fēng)流行區(qū)土壤中有55%的樣本呈陽性，而在非麻風(fēng)流行區(qū)僅有15%陽性率。Turankar等[25]利用PCR擴增土壤中麻風(fēng)菌特異性RLEP(129 bp)，并運用單核苷酸多態(tài)性(SNP)和DNA測序分析其亞型，結(jié)果表明，52份土壤樣本有17例呈陽性，亞型分析表明土壤中的麻風(fēng)菌與病人和密切接觸者均來自于同一感染源。邢燕等運用巢式PCR擴增麻風(fēng)菌特異性RLEP并對產(chǎn)物進行測序的方法，檢測了70份麻風(fēng)流行區(qū)的水和土壤樣本，有36份PCR呈陽性，經(jīng)測序確認(rèn)有21份含麻風(fēng)桿菌，確認(rèn)率達58%。由此可見，麻風(fēng)病流行村莊的水、土壤中的麻風(fēng)桿菌可能是麻風(fēng)病的傳染源。環(huán)境中麻風(fēng)菌的存在對于麻風(fēng)流行病學(xué)中的意義有待進一步研究。

3 結(jié)語

PCR的特異性好，敏感度高，操作簡便、快速，尤其是實時定量PCR技術(shù)的應(yīng)用，大大縮短了檢測時間，而且能夠?qū)毦鶧NA或RNA進行直接定量，評估病人體內(nèi)的麻風(fēng)菌指數(shù)進行臨床分型。RNA水平的定量對于監(jiān)測麻風(fēng)療效有著良好的效果。PCR與PGL-I聯(lián)合聯(lián)合測定有助于識別家庭密切者的亞臨床感染。但應(yīng)注意的是，目前報道中對麻風(fēng)桿菌檢測的目的基因或片段多不一致，檢測方法也多種多樣，各實驗室報道的敏感度、特異性變異均較大，對各個實驗室麻風(fēng)菌DNA檢測的評價體系有待完善。而且，PCR對技術(shù)要求較高，需較復(fù)雜的實驗設(shè)備及技術(shù)支持。不同核酸提取方法、污染物的控制等實驗條件，以及實驗室工作人員水平都會對檢測結(jié)果帶來影響。臨床實驗室必須充分了解 PCR測定的不確定性，并且采取相應(yīng)質(zhì)控措施，才能確保試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

同時我們也應(yīng)該看到，PCR方法檢測麻風(fēng)桿菌雖然敏感，但對麻風(fēng)的診斷仍有局限性，主要原因在于麻風(fēng)作為一個慢性傳染病，亞臨床感染以及臨床帶菌現(xiàn)象比較常見，即使常規(guī)組織液查菌檢查到抗酸桿菌，在沒有臨床表現(xiàn)時，也無法診斷麻風(fēng)?？傊?，PCR對于麻風(fēng)疑難病例如早期PB和PNL的診斷、化學(xué)藥物治療評估、耐藥性監(jiān)測和密切接觸者的監(jiān)測等提供了新的技術(shù)，隨著多種PCR技術(shù)的開發(fā)和更多敏感、特異的基因用于麻風(fēng)檢測，PCR檢測麻風(fēng)桿菌的方法將會得到越來越廣泛的應(yīng)用。

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(收稿：2016-04-20 修回：2016-11-19)

Update of polymerase chain reaction in the detection of mycobacterium leprae

LIUMin1,HAOMingju2.

1.DepartmentofClinicalLaboratory,JinanDermatosisPreventionandControlHospital,Jinan250001,China; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,QianfoMountainHospitalofShandongUniversity,Jinan250014,China.

HAOMingju,E-mail:haomingju@163.com

Earlier diagnosis and treatment of leprosy is of great importance in reducing spread of leprosy and preventing progression of disease and disability. This article summarizes the use of PCR techniques to detect Mycobacterium leprae.

leprosy; Mycobacterium leprae; polymerase chain reaction

1濟南市皮膚病防治院檢驗科，濟南，250001 2山東省千佛山醫(yī)院檢驗科，濟南，250014

郝明巨，E-mail: haomingju@163.com