HPLC-ELSD法檢測煙草秸稈中水溶性糖

吳福芳，陳 悅，蘆廣銀，馬擴彥，戴 亞，盛良全*

（1.阜陽師范學院 化學與材料工程學院，安徽 阜陽 236037；2.重慶中煙工業(yè)有限責任公司 技術研發(fā)中心，四川 重慶400060）

HPLC-ELSD法檢測煙草秸稈中水溶性糖

吳福芳1，陳 悅1，蘆廣銀1，馬擴彥2，戴 亞2，盛良全1*

（1.阜陽師范學院 化學與材料工程學院，安徽 阜陽 236037；2.重慶中煙工業(yè)有限責任公司 技術研發(fā)中心，四川 重慶400060）

建立一種采用45%乙腈水溶液作提取溶劑于40℃下超聲萃取35 min，乙腈水溶液等度洗脫，ZORBAX Carbohydrate糖柱-HPLC-ELSD法測定煙草秸稈中水溶性糖含量的方法。水溶性糖的線性范圍：鼠李糖、果糖、葡萄糖、蔗糖的實驗線性范圍為8.0～1 000.0 mg/L，木糖、甘露糖的實驗線性范圍為16.0～1 000.0 mg/L，麥芽糖的實驗線性范圍為10.0～1 000.0 mg/L，且在此范圍內相關系數(shù)均較好。相對標準偏差（RSD）（n=6）均小于3.73。結果表明此法準確簡單、易操作、靈敏度高，適用于批量煙草秸稈以及煙草制品中水溶性糖含量的定量分析與測定。

糖分析柱；高效液相色譜法；煙草秸稈；水溶性糖

我國是煙草生產大國，每年產量約占全球的42%，煙草秸稈產量約為450萬噸[1]。以往對煙草秸稈處理方式主要是焚燒和丟棄，有效利用率低。煙草秸稈作為一種重要的可再生生物質資源，它的合理開發(fā)利用有利于兩煙產業(yè)可持續(xù)發(fā)展。對煙草秸稈組成成份分析等基礎數(shù)據(jù)，是其科學、合理、有效、可持續(xù)發(fā)展的基礎[2]。目前對煙草秸稈的成份報道不是很多，其中水溶性糖的研究較少[3]。而水溶性糖是煙草秸稈的重要組成成份，對煙草秸稈水溶性糖的合理分析關系到煙草秸稈的‘五化’利用[4]。因此，選擇合適的方法及最佳測量條件，有利于煙草秸稈進一步應用研究。目前國內外農作物秸稈中的水溶性糖研究不是很多[5-9]，其對于煙草秸稈中水溶性糖的檢測主要是按照煙草行業(yè)標準（YC/T 159—2002）進行測定，沒有對煙草秸稈水溶性糖進行系統(tǒng)分析、檢測。

高效液相色譜法是近些年來檢測水溶性糖最多的方法之一，主要采用的是示差折光檢測器[10-11]和蒸發(fā)光散射檢測器[12-15]。相對于示差折光檢測器，蒸發(fā)光散射檢測器的靈敏度要高，適用范圍較廣。且比傳統(tǒng)的化學方法精確度高（能檢測單一糖的成分），耗時短，成本低。本文采用安捷倫糖分析柱為固定相、乙腈-水作流動相、蒸發(fā)光散射檢測器，實現(xiàn)了煙草秸稈中7種水溶性單糖和二糖的同時測定。為生物質秸稈中水溶性糖的快速分析奠定了一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

實驗所用煙草秸稈來自阜陽當?shù)厥崭?。YL9100高效液相色譜系統(tǒng)、YL9181蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)（托摩根生物科技有限公司）；微量進樣器（0.1mL）；分析天平（0.000 1 g）（上海越平科學儀器有限公司）；0.22μm水系微孔濾膜、0.22μm有機系微孔濾膜，SPE-C18固相萃取小柱（BOJIN），全自動固相萃取儀（SPE-8上海本昂科學儀器有限公司）；DZX-1型（6050B）真空干燥箱（上海?，攲嶒炘O備有限公司）、YB-500A型高速多功能粉碎機（永康市速鋒工貿有限公司）、SHB-ⅢS循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；UP型超聲純水機（優(yōu)普儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

準確稱取已烘至恒重的煙草秸稈粉末0.5 g，精確至0.000 1 g，置于25mL容量瓶中，加入10mL 45%（體積分數(shù)）乙腈水溶液，于40℃下超聲波輔助提取35 min，抽濾，濾液用45%乙腈水溶液定容至25mL。樣液用預活化好的SPE-C18固相萃取小柱[16-18]（活化方法：先用15mL甲醇活化，再用30mL超純水平衡）處理后，再經0.22μm有機過濾膜過濾，置于離心管中，待進樣分析。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：安捷倫ZORBAX Carbohydrate（4.6mm×250mm，5μm）（南昌捷島科學儀器有限公司）；流動相：乙腈/水（V/V）=75∶25，流速為1.0mL/min，恒溫器溫度：25℃；ELSD Spray Chamber溫度：30℃，Drift Tube溫度：60℃；載氣：高純氮（≥99.999%），壓力：0.5 MPa；進樣量：20μL。

1.2.3 標準溶液配制

準確稱取已經烘干的鼠李糖、木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖各0.1 g，甘露糖0.2 g，精確至0.000 1 g，均置于100mL小燒杯中，加適量45%乙腈水溶液，攪拌加速溶解，轉移至100mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，得糖標準儲備液，置于4℃冰箱中保存。實驗中所用工作液濃度為儲備液的0.5倍。準確移取5mL糖標準儲備液于10mL容量瓶中，用45%乙腈水溶液定容至刻度，搖勻即得到標準工作液。

2. 結果與討論

2.1 色譜條件

2.1.1 流動相的選擇

用乙腈和水作為高效液相色譜分析的流動相，在固定流速為1.0mL/min，恒溫器溫度為25℃，ELSD Spray Chamber溫度為30℃，Drift Tube溫度為60℃，N2壓力維持在0.5 MPa，分別在乙腈-水溶液體積比為70∶30、75∶25、80∶20時，進樣20μL分析各組分糖的分離情況。數(shù)據(jù)處理結果見表1。

根據(jù)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)：乙腈在流動相中比例增大，有利于各組分峰的基線分離，但是乙腈比例增大也會導致分析時間延長。在乙腈體積比為70%時，木糖與果糖，甘露糖與葡萄糖未分開，其它糖已達到完全分離；在乙腈體積比為75%時，只有木糖與果糖分離度R＜1.5，其余各峰間分離度值R≥1.5，即各糖分峰基本分離；在乙腈體積比為80%時，各峰間分離度值R＞1.5，各組分糖完全分離，但分析時間較長，但各糖分的峰展寬較嚴重，尤其是蔗糖和麥芽糖的峰較寬。綜合考慮分析時間、分離效果、峰展寬情況等因素，此次分析選擇乙腈∶水=75∶25的體系作為流動相。

流速對分離效果也具有一定的影響，流速增大可以縮短保留時間，但流速過大分離不完全，而流速過小又會導致分析時間長且峰形變寬。在乙腈∶水=75∶25條件下，進一步分析不同流速（0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min）對分離效果的影響，對譜圖進行分析后得數(shù)據(jù)表2。流速為1.0和1.2mL/min時，各峰間的分離度R≥1.3，各組分基本分離，且半峰寬也相差不大，在1.2mL/min時壓力較大，故選擇流速為1.0mL/min。

表1 不同流動相下各組分糖的分離度

表2 不同流動速度下各組分糖的分離度

2.1.2 ELSD參數(shù)設定

載氣流速，漂移管溫度與恒溫器溫度是ELSD調節(jié)的主要參數(shù)。載氣的流量決定霧化時液滴形成的大小。氣體流量越高形成的液滴越小，容易蒸發(fā)，散射光的強度較弱，產生的信號較小。但若載氣流速過小，流動相不能完全蒸發(fā)，背景噪音大。漂移管溫度的高低也同樣存在信噪比和背景噪音的問題。本實驗在N2壓力維持在0.5 MPa，漂移管溫度在60℃下，色譜圖分離情況較佳。

在確定的流動相和流速下，ELSD Spray Chamber溫度為30℃，Drift Tube溫度為60℃，N2壓力維持在0.5 MPa，進樣量為20μL，恒溫器溫度分別設置為20℃、25℃、30℃，進行進樣分析，結果顯示，恒溫器溫度對保留時間、峰形的影響都不大，在實驗中不同柱溫時，各糖分已達基本分離。25℃與室溫較接近，溫差小。故選擇了25℃作為ELSD工作溫度。條件優(yōu)化后，7個糖組份都得到較好的分離，如圖1。

2.2 樣品處理條件的優(yōu)化

2.2.1 萃取劑比例的選擇

依據(jù)文獻[15]，選用乙腈水溶液作為萃取劑，分別用0、35、40、45、50、55、60%乙腈水溶液10mL，平行做2組。相對于純水，乙腈水溶液提取時甘露糖、蔗糖和麥芽糖影響不大，但其它糖分提取效果較好。萃取劑乙腈比例在45%時，鼠李糖提取量略低于乙腈比例為40%的，但是其它各組分糖提取量較其他條件下比較好，故選擇45%乙腈水溶液作為萃取劑。實驗數(shù)據(jù)處理結果見表3，表中為平行實驗萃取平均值。

2.2.2 萃取劑體積的選擇

分別考察了萃取劑為4、6、8、10、12、14mL時萃取的結果見表4。分析數(shù)據(jù)結果可知，萃取劑體積在10mL時，樣品中糖分提取相對較完全。

圖1 7種水溶性糖混合標準溶液的HPLC-ELSD色譜圖

表3 乙腈與水不同濃度比例與水溶性糖的萃取關系

表4 不同萃取劑體積與水溶性糖的萃取關系

2.2.3 萃取時間的選擇

于40℃下超聲波輔助提取不同時間，分別為10、20、30、40、50、60 min，平行做2組。實驗結果見表5，超聲萃取大概35 min時，樣品中糖提取量最高。隨超聲時間的延長，各組分糖提取量基本不變。故選擇超聲輔助提取35 min。

表5 不同萃取時間與水溶性糖的萃取關系

2.2.4 萃取溫度的選擇

在上述選定的條件下，于30、35、40、45、50、55、60℃下超聲波輔助提取，實驗數(shù)據(jù)處理結果見表6，溫度升高有利于糖分溶出。隨著溫度的升高，糖分提取量也增加，但是溫度超過40℃時，總糖量呈現(xiàn)下降趨勢。所以樣品處理溫度選擇為40℃。

2.3 方法評價和應用

2.3.1 線性范圍與檢出限

量取配制的糖標準儲備液0.08、0.10、0.25、 0.50、1.00、2.00、5.00、8.00、10.00mL，分別置于10mL容量瓶中，用45%乙腈水溶液定容，得系列濃度的糖標準溶液。在優(yōu)化的色譜條件下進行HPLC分析，濃度由低到高依次進樣。并以各糖的峰面積（mV·S）的對數(shù)為縱坐標，以標準溶液的濃度（mg/L）的對數(shù)為橫坐標進行線性回歸，即可得到線性回歸方程。同時，處理煙草秸稈樣品20份，0.01 g/份，進行二十組空白實驗，以3倍的標準偏差計算檢出限。表7為7種水溶性糖的雙對數(shù)標準曲線。

表6 不同萃取溫度與水溶性糖的萃取關系

表7 7種水溶性糖類化合物的雙對數(shù)線性方程

水溶性糖的線性范圍：鼠李糖、果糖、葡萄糖、蔗糖的實驗線性范圍為8.0～1 000.0 mg/L，木糖、甘露糖的實驗線性范圍為16.0～1 000.0 mg/L，麥芽糖的實驗線性范圍為10.0～1 000.0 mg/L，且在此范圍內相關系數(shù)均較好。

2.3.2 精密度

準確稱取6份已烘至恒重的煙草秸稈樣品，0.500 0 g/份。預處理后在選定的色譜條件下進行HPLC分析，根據(jù)6次重復測定，記錄各組分糖的峰面積，計算相對標準偏差（RSD）。煙草秸稈中水溶性糖的精密度實驗數(shù)據(jù)處理結果見表8。除鼠李糖外，其余各糖分RSD＜3.73，表明該方法的精密度良好。

表8 煙草秸稈中水溶性糖的精密度實驗（n=6）

2.3.3 回收率和穩(wěn)定性

準確稱取3份已烘至恒重的煙草秸稈樣品，0.500 0 g/份。樣品1不加混合母液，其他2份分別加入不同等級濃度的混合母液，進行回收率實驗。平行做6組，計算相對標準偏差（RSD）。對樣品1在0、40、60、100、140、260 min后，進樣測定分析。計算于室溫下放置不同時間后糖分的濃度，判斷樣液的穩(wěn)定性。

煙草秸稈中水溶性糖的回收率實驗數(shù)據(jù)及處理結果見表9，各糖回收率為70.5%～141.2%。煙草秸稈中水溶性糖的穩(wěn)定性實驗數(shù)據(jù)處理結果見表10。根據(jù)實驗結果發(fā)現(xiàn)1 h內，樣液中水溶性糖濃度變化不大，所以最好在樣液提取后1 h內進樣檢測分析。

表9 煙草秸稈中水溶性糖的回收率實驗（n=6）

表10 煙草秸稈中水溶性糖的穩(wěn)定性實驗

3 結論

本實驗采用45%乙腈水溶液于40℃下超聲波輔助提取35 min，經過抽濾、定容，再用預活化好的SPE-C18固相萃取小柱處理，最后經0.22μm過濾膜過濾，ZORBAX Carbohydrate糖柱-高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測，建立一種煙草秸稈中水溶性糖含量測定的方法。在不同添加水平下，回收率為70.5%～141.2%，精密度（RSD）為0.77%～3.73%（n=6）。該方法準確簡單、易操作、靈敏度高、線性范圍寬，適用于批量煙草秸稈以及煙草制品中水溶性糖含量的常規(guī)檢測。

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Determination of water-soluble sugar in tobacco straw by HPLC-ELSD

WU Fu-fang1，CHEN Yue1，LU Guang-yin1，MAKuo-yan2，DAI Ya2，SHENG Liang-quan1*
(1.School of Chemistry and Materials Engineering,Fuyang Normal University,Fuyang Anhui236037,China;2.Technology R&D Center,China Tobacco Chongqing Industrial Co.,Chongqing Sichuan400060,China)

A method for determination of water-soluble sugar in tobacco straw was developed.The water-soluble sugar was extracted by using 45%acetonitrile water solution under ultrasonic,and was analyzed by HPLC-ELSD using ZORBAX Carbohydrate sugar column.The linear range of rhamnose,fructose,glucose and sucrose was 8.0～1 000.0 mg/L;the linear range of xylose and mannose was 16.0～1 000.0 mg/L;and the linear range of maltose was 10.0～1 000.0 mg/L,and the correlation coefficient is better in this range.Relative standard deviation(RSD)(n=6)was all less than 3.73.The method for determination of water-soluble sugar in tobacco straw is simple,easy to operate,accurate,sensitive and suitable for quantitative analysis and determination of water-soluble sugar in tobacco and tobacco products.

sugar analysis column;high performance liquid chromatography;tobacco straw;water-soluble sugar

TS49

：A

：1004-4329（2016）04-037-07

10.14096/j.cnki.cn34-1069/n/1004-4329(2016)04-037-07

2016-09-22

安徽省高等學校自然科學研究項目（KJ2016A548）；安徽省省級學科建設重大項目（皖教秘科[2014]28號）；卷煙減害降焦四川省重點實驗室開放課題（hx2015005）資助。

吳福芳（1985- ），女，博士，講師，研究方向：藥物合成。

盛良全(1965- ），男，博士，教授，研究方向：生物無機及分析化學。Email：shenglq@fync.edu.cn。