雙抗體夾心ELISA法檢測上海崇明水仙的5種病毒

卞黎霞

（崇明縣林業(yè)站，上海 202150）

雙抗體夾心ELISA法檢測上海崇明水仙的5種病毒

卞黎霞

（崇明縣林業(yè)站，上海 202150）

以崇明水仙露地栽培中出現(xiàn)的褪綠、斑駁、花葉和黃條等多種癥狀的植株為樣本，以水仙試管脫毒苗為參照，采用DAS-ELISA法定量檢測了煙草花葉病毒（TMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、水仙潛隱病毒（NLV）、水仙花葉病毒（NMV）和水仙黃條病毒（NYSV）5種病毒病。結(jié)果發(fā)現(xiàn)全部樣本帶毒率共計50.8%，復合感染帶毒率11.1%；54份露地栽培的樣本中TMV、CMV和NYSV帶毒率分別為38.9%、14.8%和1.85%；組培苗中TMV和CMV帶毒率分別為88.9%和11.1%。

水仙；病毒檢測；酶聯(lián)免疫吸附測定

崇明水仙（Narcissus tazetta var.chinensis）為石蒜科水仙屬多年生草本植物，是上海唯一地理品牌花卉，與福建的漳州水仙和浙江普陀水仙同屬中國水仙的栽培類型。以其濃郁芳香和優(yōu)美花型馳名中外。然而，影響崇明水仙品質(zhì)的最大問題是病毒病害，造成種球退化嚴重，嚴重影響其觀賞價值和推廣應用，檢測崇明水仙的致病病毒并利用栽培措施加以改善至關重要。

崇明水仙的病害癥狀主要表現(xiàn)為斑駁、黃條、白條、花葉、葉片扭曲，以及整個植株矮化畸形、鱗莖退化、種球變小、花枝減少、抗性減弱等。國外自1946年開始陸續(xù)報道水仙花葉病毒［1］，國內(nèi)自1985年謝光兀首次報道了中國水仙NMV（水仙花葉病毒）研究［2］，國內(nèi)外目前已先后報道了近30種侵染水仙的病毒［3］，其中包括煙草花葉病毒屬的煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、黃瓜花葉病毒屬的黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、香石竹潛隱病毒屬的水仙潛隱病毒（Narcissus latent virus，NLV）、馬鈴薯X病毒屬的水仙花葉病毒（Narcissus mosaic virus，NMV）、馬鈴薯Y病毒屬的水仙黃條病毒（Narcissus yellow stripe virus，NYSV）等。通過莖尖培養(yǎng)脫毒、熱處理結(jié)臺莖尖培養(yǎng)脫毒、愈傷組織培養(yǎng)脫毒、原生質(zhì)體培養(yǎng)脫毒、繁殖組織培養(yǎng)脫毒和莖尖微體嫁接脫毒是目前植物組培的脫毒方法［4］。DHT結(jié)合高溫處理的崇明水仙脫毒方法DHT 30 mg/L+病毒唑30 mg/L處理能使NMAV含量降低到極微弱的水平，且不影響試管球存活；DHT 10 mg/L+病毒唑10 mg/L處理可以完全脫除NDV和NCLV病毒［5］。進行病毒檢測，將有助于種植者對崇明水仙的管理。梁艷等［6］在36個水仙樣本上檢測到水仙普通潛隱病毒（NCLV）水仙退化病毒（NDV）；此外，有兩類分離物被初步鑒定為新病毒，暫命名為水仙斑駁相關病毒（NMaV）和水仙白條相關病毒（NWSaV），其中NMaV為危害水仙的優(yōu)勢病毒。本研究對以上5種病原病毒進行檢測。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

在崇明水仙病毒病調(diào)查中，取到褪綠、斑駁、花葉、黃條的田間及組培可疑病株，為明確其病原，并為病毒檢疫、病害控制、脫毒提供科學依據(jù)。

試驗用水仙于2012年4月及12月分別在上海崇明百葉水仙花合作社種植基地及上海園林科學研究所實驗室內(nèi)采集，樣本共63份，其中大田實生苗樣本54份，組培苗樣本9份，其中53份樣本明顯出現(xiàn)褪綠、斑駁、花葉、黃條等典型病毒癥狀，另11份為隱癥水仙樣本（表1）。

表1 病株樣本的來源Table 1 Sources of diseased plant samples

1．2 主要試劑

TMV、CMV、NLV、NMV和NYSV 5種病毒的抗血清、酶標二抗、陽性質(zhì)控、病毒質(zhì)控及96孔酶標板，購自英國安德珍生物技術(shù)有限公司（ADGEN Biotechnology Limited）；硝基苯磷酸酯鈉鹽（PNPP），購自Sigma公司；其它試劑均為國藥公司分析純。

1．3 雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法（DAS-ELISA）

取每個樣本1 g葉片，以樣品和提取液10 mL∶1 g的比例加10 mL提取緩沖液，充分研磨。3 000 r/min離心10 min，留上清液作為抗原。按照試劑盒要求制備陽性質(zhì)控樣品，提取緩沖液做陰性對照。分別移取所有樣本、陽性對照和陰性對照，一式2份，各100 μL，37℃孵育30 min。PBST緩沖液清洗酶標板并充滿微孔，放置3 min后倒棄，重復3次。加入100 μL稀釋后的探針抗體——一抗血清，多克隆兔抗血清，37℃孵育30 min。PBST緩沖液清洗酶標板并充滿微孔，放置3 min后倒棄，重復3次。加入100 μL酶標結(jié)合物——酶標二抗，堿性磷酸酶標記的山羊抗兔血清，37℃孵育30 min。PBST緩沖液清洗酶標板并充滿微孔，放置3 min后倒棄，重復6次，擦干；每孔加入100 μL硝基苯磷酸酯鈉鹽（PNPP）底物溶液，37℃放置1—2 h。將顯色后的酶標板置于酶標儀中，405 nm條件下讀數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2．1 DAS-ELISA檢測

2012年5月，對采集的63份崇明水仙樣本進行DAS-ELISA測定，檢出帶病樣本32份，帶毒率共計50.8%，復合感染樣本7份，復合感染帶毒率11.1%。其中感染TMV樣本29份，感染CMV樣本9份，感染NYSV樣本1份，TMV、CVM、NYSV帶毒率分別為46.0%、14.3%、1.6%；復合感染TMV和CMV樣本6份，復合感染TMV和NYSV樣本1份；均未檢出感染NLV和NMV的樣本（表2）。

表2 DAS-ELISA測定崇明水仙的帶毒率Table 2 Detection of virus-carrying rate of all the tested plants by DAS-ELISA

2．2 大田水仙實生苗DAS-ELISA檢測

54份水仙大田實生苗，經(jīng)DAS-ELISA測定，檢出帶病樣本24份，帶毒率共計44.4%。其中感染TMV樣本21份，感染CMV樣本8份，感染NYSV樣本1份，TMV、CVM、NYSV帶毒率分別為38.9%、14.8%、1.85%，復合感染TMV和CMV樣本6份，復合感染TMV和NYSV樣本1份（表3）。

表3 DAS-ELISA測定大田水仙實生苗的帶毒率Table 3 Detection of virus-carrying rate of open-cultured plantlets by DAS-ELISA

2．3 水仙組培苗DAS-ELISA檢測

9份水仙組培苗，經(jīng)DAS-ELISA測定，檢出帶病樣本8份，全部感染TMV，帶毒率共計88.9%，其中一份復合感染TMV和CMV，CMV帶毒率11.1%（表4）。

表4 DAS-ELISA測定水仙組培苗的帶毒率Table 4 Detection of virus-carrying rate of tissue-cultured plantlets by DAS-ELISA

3 結(jié)論與討論

根據(jù)新西蘭的4個水仙品種（‘Carlton’，‘Fortune’，‘Ice Follies’，‘Soleild Or’）試驗可以看出，低病毒球莖提供優(yōu)越產(chǎn)率，并可至少維持兩年。脫毒技術(shù)使水仙種球提純復壯，是崇明水仙走出困境的行之有效的方法［7］。2012年，在上海崇明水仙病毒病調(diào)查中，進行的TMV、CMV、NLV、NMV及NYSV 5種病毒的檢測，結(jié)果表明TMV、CMV為侵染崇明水仙的主要病毒。TMV、CMV兩者都為RNA病毒，其中TMV能在多種植物上越冬，通過汁液摩擦能侵染大麥、小麥、本明煙、莧色藜，也可通過嫁接傳播［8-9］，葉片輕微摩擦造成微傷口，病毒即可侵入，植株染病后出現(xiàn)花葉癥狀，生長陷于不良狀態(tài)，葉常呈畸形；CMV主要在多年生宿根植物上越冬，主要由蚜蟲以非持久性方式進行傳播，?；暂^低，目前認為CMV可以由80多種蚜蟲傳播［10-12］，植株染病后葉枯黃，小且皺縮，呈現(xiàn)花葉狀。據(jù)報道，在危害中國水仙的病毒種類中，以水仙花葉病毒（NMV）和水仙黃條病毒（NYSV）最為普遍［13］，兩者粒子均呈線狀［14］。因此，在崇明地區(qū)，當下迫切需要采取有效措施防止TMV、CMV的持續(xù)蔓延。但是，此次在受檢的崇明水仙樣本中未檢測到NMV，目前崇明水仙上共有4種病毒，分別是已報道的水仙普通潛隱病毒（NCLV）、水仙退化病毒（NDV）和兩種未報道的新病毒分離物NMaV、NWSaV，其中NMaV為危害上海崇明水仙的優(yōu)勢病毒，田間多數(shù)情況下與NCLV、NDV等病毒復合侵染［6］。上海崇明水仙病毒病病原種類鑒定的報道相一致，NYSV僅在大田實生苗中檢測到1份，表明當前這兩種病毒在上海崇明水仙上仍可能不是主要的病毒種類。然而，水仙病毒感染植株的速度非?？?，在栽培漳州水仙1個月后就可出現(xiàn)病毒病的癥狀，三個月后可達100%［15］。NYSV能通過汁液傳播，也能通過蚜蟲非持久性傳播，對水仙的經(jīng)濟價值影響很大，崇明水仙感病后表現(xiàn)出花葉、黃條、花瓣開裂和鱗莖矮小等癥狀［16］。雖然目前僅檢測出1份樣本感染NYSV，但也需引起重視，加強防疫，避免廣泛傳播感染。崇明水仙為同源三倍體，具高度不孕性，雖然子房膨大，但種子空癟，只能以鱗莖作分球繁殖。由于長期的無性繁殖，植物病毒在球莖中的大量積累，造成產(chǎn)量逐年萎縮，種性退化，失去觀賞價值和商品性。此次崇明水仙未經(jīng)脫毒的組培苗病毒檢測中，TMV感染率88. 9%，其中1份樣品復合感染TMV和CMV，1份樣品在5種病毒檢測中均呈陰性，這為崇明水仙的組培脫毒篩選培養(yǎng)提供了依據(jù)，也為下一步脫毒工作奠定了基礎。

上海崇明水仙大田實生苗病毒檢測中，出現(xiàn)了病毒復合侵染的情況。病毒復合侵染，會致使單種病毒難于被純化出來，從而使得一些傳統(tǒng)鑒定方法效果不佳，例如癥狀觀察、鑒別寄主反應等。相比傳統(tǒng)的病毒檢測方法，血清學ELISA靈敏度高，需要的樣本材料少，特異性強，并且安全、快速、易觀察結(jié)果，與RT-PCR等現(xiàn)代分子手段相結(jié)合，進行檢測、鑒定將更加準確。

在此次病毒檢測中，有少部分具有明顯癥狀的樣本，未檢測出感染TMV、CMV、NLV、NMV及NYSV 5種病毒。由于病毒檢測選定在以上5種類型，相對比較局限，在一定程度上可能會影響鑒定的準確性。因此，需要采用更為精準的檢測方法進行病毒病病原種鑒定，最終確定這5種病毒病之外的病毒感染類型，為上海崇明水仙的將來打下更堅實的根基。

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（責任編輯：程智強）

Double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbant assay of 5 species of viruses in Chinese narcissus in Chongming，Shanghai

BIAN Li-xia
（Forestry Station of Chongming County，Shanghai 202150，China）

With detoxified test-tube plantlets of Chinese narcissus as CK，the open-cultured plants having such leaf symptoms as chlorisis，mottle，mosaic and yellow stripe were used as test materials，5 viral diseases—Tobacco mosaic virus（TMV），Cucumber mosaic virus（CMV），Narcissus latent virus（NLV），Narcissus mosaic virus（NMV），Narcissus yellow stripe virus（NYSV）—were quantitatively detected by double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbant assay（DAS-ELISA）.The results showed that the virus-carrying rate of all the tested plants was 50.8%，and the compound infection rate was 11.1%；In the 54 open-cultured plant samples the rates of carrying TMV，CMV and NYSV were 38.9%，14.8%，and 1.85%respectively，and in the tissuecultured plantlets the rates of carrying TMV and CMV were 88.9%and 11.1%respectively.

Chinese narcissus；Virus detection；ELISA

S436.8；S682.2

A

1000-3924（2016）06-033-04

2015-11-03

上海市科技資助項目（13391912502）

卞黎霞（1978—），女，學士，工程師，主要從事植物保護及花卉、林果栽培。Tel：18918775072，E-mail：cmlinye＠163.com