基于高通量測(cè)序的青石斑魚(yú)基因組微衛(wèi)星開(kāi)發(fā)及評(píng)價(jià)*

高峰濤， 邵長(zhǎng)偉， 崔忠凱， 王升鵬， 魏 敏， 陳松林**， 楊官品

(1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237)

基于高通量測(cè)序的青石斑魚(yú)基因組微衛(wèi)星開(kāi)發(fā)及評(píng)價(jià)*

高峰濤1,2,3， 邵長(zhǎng)偉2,3， 崔忠凱2,3， 王升鵬2,3， 魏 敏2,3， 陳松林2,3**， 楊官品1

(1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237)

本研究采用基因組高通量隨機(jī)測(cè)序的方法對(duì)青石斑魚(yú)(Epinephelusawoara)微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行了發(fā)掘， 結(jié)果共獲得青石斑魚(yú)(Epinephelusawoara)基因組原始數(shù)據(jù) 2.860 G。采用MISA (MIcroSAtellite) 軟件進(jìn)行微衛(wèi)星位點(diǎn)搜索，獲得967 657條微衛(wèi)星序列。隨機(jī)選取了96條微衛(wèi)星序列設(shè)計(jì)引物并利用8尾青石斑魚(yú)個(gè)體進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)篩選，共獲得60個(gè)具有多態(tài)的微衛(wèi)星標(biāo)記。利用其中16個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)一個(gè)青石斑魚(yú)親魚(yú)群體的種群遺傳學(xué)特征進(jìn)行評(píng)價(jià)，共檢測(cè)到129 個(gè)等位基因，單個(gè)標(biāo)記的表觀等位基因數(shù)(NA) 分布范圍為2～14，平均為7.167；表觀雜合度(HO) 分布范圍為0.422～1.000，平均為0.678 6；期望雜合度(HE) 分布范圍為0.481～0.893，平均為0.676 8。有5個(gè)標(biāo)記的等位基因頻率不符合“哈迪-溫伯格平衡”，其中EAW-55596、EAW-21755、EAW-30334 3個(gè)標(biāo)記表現(xiàn)為雜合子顯著缺失(P<0.05)，而EAW-33674和EAW-52520 2個(gè)標(biāo)記表現(xiàn)為雜合子顯著過(guò)剩(P<0.05)。連鎖不平衡檢測(cè)表明各位點(diǎn)間無(wú)連鎖不平衡現(xiàn)象。多態(tài)信息含量(PIC)分布范圍為0.362 3～0.872 2，平均PIC=0.639 7>0.5，說(shuō)明該親魚(yú)群體的遺傳多樣性比較高。而這些微衛(wèi)星標(biāo)記將對(duì)于青石斑魚(yú)的遺傳變異分析、親緣關(guān)系鑒定提供了技術(shù)支持，這也將為青石斑魚(yú)的分子遺傳育種奠定了基礎(chǔ)。

青石斑魚(yú)；高通量測(cè)序；微衛(wèi)星標(biāo)記；多態(tài)性；群體遺傳評(píng)價(jià)

青石斑魚(yú)(Epinephelusawoara) 隸屬于鱸形目(Perciforme)，鮨科 (Serranidae)，石斑魚(yú)亞科 (Epinephelinae)，石斑魚(yú)屬(Epinephelus)，主要分布于北太平洋西部，中國(guó)則分布于南海及東海南部[1-3]，青石斑魚(yú)，肉質(zhì)細(xì)膩，味道鮮美、目前中國(guó)產(chǎn)出的青石斑魚(yú)已遠(yuǎn)銷國(guó)外，不僅暢銷而目售價(jià)甚高，為海產(chǎn)名貴魚(yú)類之一[4]。作為一種重要的海水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，青石斑魚(yú)的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)卻非常有限[5]，Upadhyay參考東大西洋石斑魚(yú)等近緣物種的微衛(wèi)星序列所開(kāi)發(fā)獲得了23條青石斑魚(yú)微衛(wèi)星標(biāo)記[6]。Upadhyay利用RAPD技術(shù)對(duì)青石斑魚(yú)的兩個(gè)群體的遺傳多樣性進(jìn)行了分析[7]。董秋芬等[8]、劉麗等[9]利用構(gòu)建小片段基因組DNA文庫(kù)，篩選獲得了96條微衛(wèi)星序列。Zhao等[10]通過(guò)生物素-磁珠吸附微衛(wèi)星富集法(FISCO)獲得了56 條青石斑魚(yú)微衛(wèi)星序列。在《2015年世界自然保護(hù)聯(lián)盟受威脅種群紅色目錄》中青石斑魚(yú)仍被列為研究數(shù)據(jù)缺乏的物種[11]。而微衛(wèi)星作為一種共顯性標(biāo)記在基因組內(nèi)均勻分布，數(shù)量多，多態(tài)性信息豐富，易于檢測(cè)，也是目前對(duì)海洋生物遺傳多樣性分析研究中使用最為廣泛的分子標(biāo)記[12]。因此大量發(fā)掘青石斑魚(yú)的微衛(wèi)星標(biāo)記，并以此建立青石斑魚(yú)類種質(zhì)資源分析和評(píng)價(jià)技術(shù)體系，對(duì)于更好地開(kāi)發(fā)利用優(yōu)良性狀種質(zhì)資源具有重大意義。

本研究利用高通量隨機(jī)測(cè)序的方法對(duì)青石斑魚(yú)進(jìn)行了微衛(wèi)星標(biāo)記挖掘，并利用多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)一個(gè)青石斑魚(yú)親魚(yú)群體進(jìn)行種群遺傳學(xué)特征評(píng)價(jià)，以期為青石斑魚(yú)的分子輔助育種提供幫助，為培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆、抗病的青石斑魚(yú)優(yōu)良品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)中所用的青石斑魚(yú)為大華農(nóng)水產(chǎn)有限公司(廣州)親魚(yú)群體。剪取尾部鰭條少許于離心管中，加入無(wú)水乙醇，置于-20 ℃ 保存。

1.2 基因組DNA的提取

使用“OMEGA 組織DNA提取試劑盒”對(duì)樣品的基因組DNA 進(jìn)行提取(具體操作方法參照說(shuō)明書(shū)，略有改動(dòng))。經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)樣品DNA 進(jìn)行檢測(cè)，置于-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 高通量測(cè)序與微衛(wèi)星位點(diǎn)的挖掘

使用HiSeq4000 高通量測(cè)序儀 (Illumina，USA) 對(duì)青石斑魚(yú)基因組DNA 進(jìn)行“全基因組隨機(jī)測(cè)序” (測(cè)序服務(wù)由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供)。過(guò)濾掉接頭、低質(zhì)量序列后使用MISA (MIcroSAtellite) (http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)軟件搜索微衛(wèi)星位點(diǎn)[13]。

1. 4 引物設(shè)計(jì)與篩選

使用Premier 5.0 軟件在微衛(wèi)星側(cè)翼序列上設(shè)計(jì)引物。所設(shè)計(jì)引物的主要參數(shù): GC 含量：45%～55%；引物長(zhǎng)度：18～25 bp，退火溫度：55～60 ℃，預(yù)期產(chǎn)物長(zhǎng)度130～300 bp。所設(shè)計(jì)引物交由北京金唯智生物公司合成。

隨機(jī)選取青石斑魚(yú)親魚(yú)群體中的8尾個(gè)體的基因組DNA 作為模板，對(duì)合成的引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，并優(yōu)化反應(yīng)條件[14]。PCR 反應(yīng)體系為15 μL，其中包括10×PCR Buffer(Mg2+) 1.5 μL， dNTP(2.5 mmol·μL-1) 1.2 μL， 上、下游引物各0.5 μL，Taq酶(5 U·μL-1) (Takara，大連) 0.3 μL， DNA模板1 μL，滅菌去離子水 10 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸10 min；4 ℃ 保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)6%聚丙烯凝膠電泳進(jìn)行等位基因分型，并由硝酸銀染色，顯色，數(shù)碼相機(jī)拍照保存。

1. 5 青石斑魚(yú)親魚(yú)群體的種質(zhì)遺傳學(xué)評(píng)價(jià)

隨機(jī)挑選48尾青石斑魚(yú)的親魚(yú)基因組DNA作為模板，用16個(gè)具有多態(tài)的微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行種群的遺傳學(xué)特征評(píng)價(jià)(見(jiàn)表1)。采用的PCR體系、條件及基因分型方法同上述。校正電泳偏差識(shí)別并統(tǒng)計(jì)等位基因。使用軟件GENEPOP3.4 計(jì)算各位點(diǎn)是否符合“哈迪-溫伯格平衡”[15]，并用Bonferroni予以校正[16]，使用軟件FSTAT2.9.4計(jì)算各位點(diǎn)間的連鎖不平衡關(guān)系[17]，使用軟件Popgen32計(jì)算每個(gè)標(biāo)記的等位基因數(shù)(Number of alleles,NA)、有效等位基因數(shù)(Effective number of alleles,NE)表觀雜合度(Observed heterozygosity,HO)、期望雜合度(Expected heterozygosity,HE)和多態(tài)信息含量(Polymorphism Information Content,PIC)等種群遺傳學(xué)特征值[18]。

2 結(jié)果

2.1 高通量測(cè)序和微衛(wèi)星位點(diǎn)搜索

對(duì)青石斑魚(yú)進(jìn)行基因組隨機(jī)高通量測(cè)序，共獲得原始序列數(shù)據(jù)2.860 Gbp。過(guò)濾掉接頭、低質(zhì)量序列后，采用MISA (MIcroSAtellite)軟件進(jìn)行微衛(wèi)星位點(diǎn)搜索，獲得967 657條微衛(wèi)星序列(未公開(kāi))。

2.2 PCR引物設(shè)計(jì)和篩選

隨機(jī)挑選96條微衛(wèi)星序列并設(shè)計(jì)引物，以8尾青石斑魚(yú)個(gè)體的基因組DNA 為模板，對(duì)設(shè)計(jì)的PCR 引物進(jìn)行篩選，共篩選到具有多態(tài)性的位點(diǎn)的引物60對(duì)。

2.3 基于微衛(wèi)星標(biāo)記的種群遺傳學(xué)評(píng)價(jià)

隨機(jī)選取16個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)青石斑魚(yú)親魚(yú)群體進(jìn)行種群遺傳學(xué)評(píng)價(jià)(見(jiàn)圖1)。其中共檢測(cè)到129 個(gè)等位基因。單個(gè)標(biāo)記的表觀等位基因數(shù)(NA) 分布范圍為2～14，平均為7.167；表觀雜合度(HO) 分布范圍為0.422～1，平均為0.678 6；期望雜合度(HE) 分布范圍為0.481～0.893，平均為0.676 8(見(jiàn)表2) ?！肮?溫伯格平衡”檢驗(yàn)的結(jié)果表明，經(jīng)Bonferroni校正后有5個(gè)標(biāo)記的等位基因頻率不符合“哈迪-溫伯格平衡” (見(jiàn)表2) 。連鎖不平衡檢測(cè)的結(jié)果表明，所有標(biāo)記對(duì)間均不存在連鎖不平衡現(xiàn)象。

3 討論

3.1 高通量測(cè)序技術(shù)在發(fā)掘微衛(wèi)星序列的優(yōu)越性

傳統(tǒng)的微衛(wèi)星分離技術(shù)包括小片段DNA克隆法和微衛(wèi)星富集文庫(kù)法[19]。Upadhyay參考東大西洋石斑魚(yú)等近緣物種的微衛(wèi)星序列所開(kāi)發(fā)獲得了23條青石斑魚(yú)微衛(wèi)星標(biāo)記[6]。董秋芬等[8]、劉麗等[9]利用構(gòu)建小片段基因組DNA文庫(kù)，篩選獲得了96條微衛(wèi)星序列。Zhao等[10]通過(guò)FISCO法獲得了56 條青石斑魚(yú)微衛(wèi)星序列。上述開(kāi)發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記雖然在一定程度上可以滿足諸如種群遺傳多樣性評(píng)估、遺傳結(jié)構(gòu)分析、親緣關(guān)系鑒定等工作，但遠(yuǎn)不能滿足如連鎖圖譜構(gòu)建、QTL精細(xì)定位及分子輔助育種等對(duì)分子標(biāo)記需求量較大的研究需要[14，20]。隨著測(cè)序成本的降低及測(cè)序平臺(tái)通量的不斷擴(kuò)大，利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)基因組進(jìn)行隨機(jī)測(cè)序即可獲得海量的微衛(wèi)星序列，具有通量大、周期性短的特點(diǎn)。而本研究利用了HiSeq4000 高通量測(cè)序儀進(jìn)行基因組測(cè)序，其測(cè)序通量達(dá)到了1.5 T/run，同時(shí)測(cè)序讀長(zhǎng)達(dá)到2×150 bp；測(cè)序速度達(dá)到3.5 d/run，體現(xiàn)出了明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)[21]，獲得了967 657 條青石斑魚(yú)微衛(wèi)星序列，這對(duì)于篩選高質(zhì)量多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記以及后續(xù)的良種選育工作提供了重要保障。

3.2 青石斑魚(yú)親魚(yú)群體的種群遺傳學(xué)特征

本研究所用的青石斑魚(yú)群體為大華農(nóng)水產(chǎn)有限公司(廣州)的親魚(yú)群體，是由取自南海五個(gè)不同的海域石斑魚(yú)個(gè)體組成，隨機(jī)選取了48尾作為實(shí)驗(yàn)樣本，經(jīng)Bonferroni校正后有5個(gè)標(biāo)記的等位基因頻率不符合“哈迪-溫伯格平衡”。其中EAW-55596、 EAW-21755、EAW-30334 3個(gè)標(biāo)記表現(xiàn)為雜合子顯著缺失(P<0.05)，而EAW-33674和EAW-52520 2個(gè)標(biāo)記表現(xiàn)為雜合子顯著過(guò)剩(P<0.05)，其中分析原因一方面可能是由于過(guò)度捕撈、生態(tài)條件惡化等造成了野生石斑魚(yú)數(shù)量減少或一定程度上的種質(zhì)退化，致使其種群結(jié)構(gòu)受到影響[22]。另外，該群體是由取自5個(gè)不同海域個(gè)體組成，人為干擾因素較大，導(dǎo)致多個(gè)基因頻率不符合“哈迪-溫伯格平衡”。

注：PHWE.“哈迪-溫伯格”平衡顯著性檢驗(yàn)P值; *.經(jīng)過(guò)“sequential Bonferroni”校正后仍然背離“哈迪-溫伯格定律”校正P≤0.05 ；**.P≤0.01。PHWE. Hardy-Weinberg probability test; *.Locus deviated from Hardy-Weinberg proportions adjustedP-value≤0.05；**.P≤0.01 EAW-33674， EAW-52520.

本研究中利用16個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在青石斑魚(yú)群體共檢測(cè)到129個(gè)等位基因。單個(gè)標(biāo)記的表觀等位基因數(shù)(NA) 分布范圍為2～14，平均為7.167，均大于董秋芬等[8]、劉麗等[9]，Zhao等[10]所采用青石斑魚(yú)群體的平均等位基因個(gè)數(shù)(分別為3.69和4.83),說(shuō)明本研究中所應(yīng)用的微衛(wèi)星標(biāo)記在此青石斑魚(yú)群體中已表現(xiàn)出較高的長(zhǎng)度多樣性和優(yōu)良的遺傳素質(zhì)，能夠?yàn)榍嗍唪~(yú)種群的遺傳多樣性評(píng)價(jià)、親緣關(guān)系鑒定等提供良好的技術(shù)基礎(chǔ)。群體雜合度是反映群體在多個(gè)基因上的遺傳變異及群體遺傳多樣性豐富度。群體雜合度越高，表明該群體的遺傳變異越多，群體遺傳多樣性越高[23]該群體的表觀雜合度(HO) 分布范圍為0.391～1；期望雜合度(HE) 分布范圍為0.481～0.893。平均期望雜合度(HE)為0.676 8，平均觀測(cè)雜合度(HO)為0.678 6，與Zhao等[10]所采用青石斑魚(yú)群體類似(平均HE為0.663 3，平均HO為0.718 3)，卻高于董秋芬等[8]、劉麗等[9]所采用青石斑魚(yú)群體(平均HE為0.507 8，平均HO為0.598 2)；本實(shí)驗(yàn)群體的PIC分布范圍為0.362 3～0.872 2，平均PIC=0.639 7>0.5，也高于董秋芬等[8]、劉麗等[9]所采用的青石斑魚(yú)群體(平均PIC=0.472 2)。上述結(jié)果說(shuō)明本研究中所用的青石斑魚(yú)親魚(yú)群體的遺傳多樣性比較高。這對(duì)于指導(dǎo)該親魚(yú)群體的人工繁育，合理避免近親交配，保護(hù)和利用群體的遺傳多樣性，促進(jìn)是優(yōu)良種質(zhì)的獲得以及青石斑魚(yú)人工繁育產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究通過(guò)對(duì)青石斑魚(yú)基因組隨機(jī)測(cè)序獲得了的967 657 條微衛(wèi)星序列，與傳統(tǒng)方法相比，具有明顯的優(yōu)勢(shì)，今后將成為開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星主要的技術(shù)手段。隨機(jī)選取了96條微衛(wèi)星序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)篩選，共獲得60個(gè)具有多態(tài)的微衛(wèi)星標(biāo)記。利用開(kāi)發(fā)的16個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)一個(gè)青石斑魚(yú)親魚(yú)群體進(jìn)行了遺傳多樣性分析研究，證明了該石斑魚(yú)親魚(yú)群體的遺傳多樣性比較高，且本研究中所開(kāi)發(fā)的青石斑魚(yú)微衛(wèi)星標(biāo)記在測(cè)試群體中表現(xiàn)出較高的片段長(zhǎng)度多樣性和優(yōu)良的遺傳素質(zhì)，能夠?yàn)榍嗍唪~(yú)種群的遺傳多樣性評(píng)價(jià)、種群遺傳評(píng)價(jià)等提供良好的技術(shù)基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯 高 蓓

Development and Population Genetic Diversity Analysis of Microsatellite Markers inEpinephelusawoara

GAO Feng-Tao1,2,3，SHAO Chang-Wei2,3，CUI Zhong-Kai2,3，WANG Sheng-Peng2,3，WEI Min2,3，CHEN Song-Lin2,3，YANG Guan-Pin1

(1.College of Marine Life Science, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2.Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences (CAFS), the Key Laboratory for Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Qingdao 266071, China; 3.Laboratory for Marine Fisheries, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology， Qingdao 266237, China)

In this study，The microsatellites ofEpinephelusawoarawere isolated， and the genetic diversity were analysed. Firstly, High throughput sequencing technology was used to develop microsatellites ofEpinephelusawoara, and 2.860 Gbp raw data was obtained. Microsatellites were identified by screening the genome sequences using software MISA(MIcroSAtellite), and 967 657 different kinds of repeat motif types of microsatellite sequences were discovered. Ninety-six pairs of primers were designed according to unique microsatellite flanking sequences for amplification by polymerase chain reaction (PCR) with the software Primer 5.0, among which 60 loci were clearly amplified and shown polymorphic. In this paper, 16 polymorphic microsatellite loci were characterized to evaluate the genetic diversity of parent population (48 individuals included) ofEpinephelusawoara. A total of 129 alleles were detected, the number of alleles per loci ranged from 4 to 14 and effective number of alleles ranged from 1.905 9 to 8.295 3 with the average of 7.166 7 and 4.241 1, respectively. The observed heterozygosities (HO) were from 0.422 to 1.000 (mean=0.678 6), and the expected heterozygosities (HE) ranged from 0.481 to 0.893 (mean=0.676 8). Five loci deviated significantly from the Hardy-Weinberg equilibrium. Three markers indicated significant heterozygote deficiency including EAW-55596, EAW-21755 and EAW-30334. Otherwise, EAW-33674 and EAW-52520 indicated significant heterozygote excess. And none of the loci combinations showed significant linkage disequilibrium. The polymorphism information content (PIC) was from 0.362 3 to 0.872 2 (mean=0.639 7>0.5), and this result indicated that the genetic diversity of population was at high level. Thus, these microsatellite loci first presented useful molecular markers in the analysis of the genetic variability and in the investigation of genetic relations ofEpinephelusawoara, which will provide a basis for genetic breeding.

Epinephelusawoara; high-throughput sequencing; microsatellite; polymorphism; genetic diversity of population

山東省泰山學(xué)者項(xiàng)目資助

2016-05-17；

2016-06-30

高峰濤(1986-)男，博士生，主要從事分子生物學(xué)及生物資源方面的研究。

** 通訊作者：E-mail: chensl@ysfri.ac.cn

S917.4

A

1672-5174(2017)04-052-06

10.16441/j.cnki.hdxb.20160185

高峰濤, 邵長(zhǎng)偉, 崔忠凱, 等. 基于高通量測(cè)序的青石斑魚(yú)基因組微衛(wèi)星開(kāi)發(fā)及評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2017, 47(4): 52-57.

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