應(yīng)用共聚焦顯微拉曼光譜儀檢測鐵皮石斛不同部位多糖含量初探

胡小倩

（浙江大學(xué)，浙江 杭州 310000）

應(yīng)用共聚焦顯微拉曼光譜儀檢測鐵皮石斛不同部位多糖含量初探

胡小倩

（浙江大學(xué)，浙江 杭州 310000）

美國Thermo Scientificic公司的DXR激光共聚焦顯微拉曼光譜儀，結(jié)合了拉曼光譜分析技術(shù)與顯微鏡分析技術(shù)，不僅具有常規(guī)拉曼光譜非破壞性、檢測時間短、樣品需求量小、樣品制備簡單等優(yōu)點，輔以高倍光學(xué)顯微鏡，還具有微觀、原位、多相態(tài)、穩(wěn)定性好、空間分辨率高等優(yōu)點。本研究旨在探索應(yīng)用共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)測定鐵皮石斛的根、莖、葉和花的多糖含量，在提高多糖含量測定效率的同時，將共聚焦纖維拉曼光譜技術(shù)應(yīng)用到中藥有效成分檢測方面，為相關(guān)研究提供新的技術(shù)方法。

共聚焦顯微拉曼光譜儀；鐵皮石斛；多糖含量；檢測

顯微拉曼儀具有很好的空間分辨率，樣品分析時將入射光通過顯微鏡聚焦到樣品上，從而可以在不受周圍物質(zhì)干擾的情況下，精確獲得所照樣品微區(qū)的有關(guān)化學(xué)成分、晶體結(jié)構(gòu)、分子相互作用以及分子取向等各種拉曼光譜信息。應(yīng)用共聚焦顯微拉曼光譜儀檢測鐵皮石斛不同部位多糖含量，能夠有效提高相應(yīng)的檢測結(jié)果，這對提高石斛有效多糖的利用率具有重要意義。

1 拉曼光譜及鐵皮石斛簡介

拉曼光譜又稱拉曼效應(yīng)，是以發(fā)現(xiàn)者印度人C.V. Raman命名的。德文文獻中常稱之為邁克爾—拉曼效應(yīng)，而蘇聯(lián)前若干年的文獻中則稱之為聯(lián)合散射。拉曼于1928年在CCl4光譜中發(fā)現(xiàn)了當(dāng)光與分子相互作用后，一部分光的波長會發(fā)生變化（顏色發(fā)生變化），通過對于這些顏色發(fā)生變化的散射光的研究，可以得到分子結(jié)構(gòu)的信息，因此將這種效應(yīng)命名為Raman效應(yīng)[3]。

鐵皮石斛（Dendrobium candidurn Wall．ex Lindnd．）為蘭科石斛屬（Dendrobium Sw．）多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，素有“中華仙草”、“藥中黃金”之美稱，列“中華九大仙草”之首。近些年研究表明，鐵皮石斛具有滋養(yǎng)陰津、增強體質(zhì)、補益脾胃、護肝利膽、清虛熱、強筋壯骨、降低血糖、抑制腫瘤、明亮眼目、滋養(yǎng)肌膚和延年益壽等功效。由于長期的過度開采，野生鐵皮石斛瀕臨滅絕，現(xiàn)已被國家列為重點保護野生藥材。目前絕大部分野生藥材是應(yīng)用植物組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)進行種苗繁育的，但當(dāng)前所應(yīng)用的鐵皮石斛人工種植技術(shù)均存在所用品系復(fù)雜、品種退化等現(xiàn)象，造成在大規(guī)模生產(chǎn)中所用的種質(zhì)資源遺傳性狀參差不齊、品質(zhì)不穩(wěn)定、有效成分可溶性多糖含量低、生活力弱、栽培困難等問題。浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)試驗站植物種質(zhì)改良中心經(jīng)過多年研究，利用雜交育種技術(shù)和人工誘變技術(shù)改良鐵皮石斛的遺傳性狀，首次在藥用石斛的生產(chǎn)上利用雜交優(yōu)勢技術(shù)，重點培育鮮食型鐵皮石斛新品種（鮮食鐵皮石斛可以最完整地保存鐵皮石斛的有效成分），該鮮食鐵皮石斛多糖含量高、品性穩(wěn)定。

2 檢測方法及重點

2.1 建立鐵皮石斛多糖成分的定性分析方法

選用3年齡人工組培鐵皮石斛栽培苗，采集新鮮植株不同部位作為檢測樣本，挑選適當(dāng)波長的激光光源以減少熒光干擾，采用主成分分析算法處理共聚焦顯微拉曼光譜，指認光譜中波峰化學(xué)基團歸屬，實現(xiàn)多糖定性分析。

2.2 掃描位置選取

選取樣本的適當(dāng)位置對其進行拉曼光譜的面掃描測定，在位置選取的時候，盡量保證樹脂的厚度最薄、細胞的輪廓明顯，并且所做的面掃描中至少要包含一個上表皮細胞和一個柵欄組織細胞。

2.3 建立鐵皮石斛多糖的定量分析方法

結(jié)合鐵皮石斛多糖成分的拉曼指紋普帶信息，采用計算機優(yōu)化算法和化學(xué)計量學(xué)方法，篩選出波峰明顯且專一性好的譜帶，作為多糖成分的定量峰，實現(xiàn)多糖成分定量檢測。

2.4 研究關(guān)鍵點

篩選出適當(dāng)波長的激光光源以及最優(yōu)化的檢測條件的設(shè)定。

3 檢測意義及結(jié)果

準(zhǔn)確測定鐵皮石斛多糖含量以及在植株根、莖、葉和花中的分布情況，對提高石斛有效多糖的利用率具有重要意義。陳云龍等研究過野生細莖石斛不同部位的有效成分及其分別規(guī)律[2]。尚喜雨取鐵皮石斛的不同部位，通過將鐵皮石斛先殺青后烘干和先室溫放置后暴曬制成的干燥粉末。采用微波輔助的方法，對上述材料中的石斛多糖進行提取，多糖含量進行測定，測得結(jié)果為：鐵皮石斛的多糖含量很高，尤以莖段為最；不同部位的含量存在一定差異，莖部的差異要大于根、葉的；人工栽培兩年生植株的多糖含量要比一年生的多，野生型的比栽培型的多[1]。浙江大學(xué)華允芬博士在其博士論文中借助現(xiàn)代色譜技術(shù)如體積排阻色譜 (SEC)、凝聚滲透色譜(GPC)、高效離子交換色譜 (HPAEC-PAD)、薄層色譜(TLC)和氣相色譜(Gc)等，光譜技術(shù)如紫外光譜(uV)、紅外光譜(破)、質(zhì)譜(Ms)和核磁共振光譜以及其他手段輔助如高碘酸氧化、酸降解或酶降解，對鐵皮石斛的多糖進行了系統(tǒng)的分析和比較研究。以上檢測方法都需要對樣品植物組織進行分解、提純等化學(xué)過程，耗時費力，而且樣品處理過程會消耗分解改變多糖含量。

4 小結(jié)

本項目探索采用共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)，實現(xiàn)快速、簡單、可重復(fù)、無損傷地測定鮮食鐵皮石斛不同部位多糖含量，將高新技術(shù)應(yīng)用到新的領(lǐng)域，在實現(xiàn)植物組織成分快速檢測的同時，也為相關(guān)領(lǐng)域（醫(yī)藥行業(yè)）的有關(guān)研究提供新思路、新方法。本項目研究成果應(yīng)用前景廣闊，對中藥成分檢測研究具有很強的實際指導(dǎo)意義。

[1]尚喜雨.多糖在不同來源不同部位鐵皮石斛中的分布規(guī)律[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2010(13):104-105.

[2]陳云龍,張銘,華允芬,等.細莖石斛不同部位有效成分及分布規(guī)律研究[J].中國中藥雜志,2001,26(10): 709-710.

[3]張光濃,畢志明,王崢濤,等.石斛屬植物化學(xué)成分研究進展[J].中草藥,2003,34 (6):C5-C8.

1005-2690（2017）02-0078-02

S567.239

B

2017-01-17）

胡小倩（1982-），女，河北隆堯人，研究生，實驗師，從事植物真菌病害研究與防治工作。