淺談神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病基因診斷策略及問題

李洵樺 陳定邦 吳超

.專題綜述.

淺談神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病基因診斷策略及問題

李洵樺 陳定邦 吳超

神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病臨床癥狀復(fù)雜、診斷困難,基因檢測(cè)是明確診斷的終極手段.近年來分子診斷技術(shù)的進(jìn)步、方法的更新,尤其是二代基因測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用,使從眾多檢測(cè)方法中選擇適宜的基因檢測(cè)方法成為臨床醫(yī)師的新挑戰(zhàn).本文擬從疾病臨床表型出發(fā),結(jié)合不同基因突變和基因檢測(cè)方法,對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)單基因遺傳病基因診斷策略及問題進(jìn)行綜述.

遺傳性疾病,先天性; 神經(jīng)系統(tǒng)疾病; 基因; 綜述

迄今已經(jīng)確定的單基因遺傳病近5000種,其中大多數(shù)累及神經(jīng)系統(tǒng),導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病.神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病種類繁多且罕見,臨床癥狀復(fù)雜,具有高度遺傳異質(zhì)性和臨床異質(zhì)性,且各種疾病之間癥狀常重疊,故臨床診斷困難,基因檢測(cè)是明確診斷的終極手段.近年來,分子診斷技術(shù)的不斷進(jìn)步,尤其是二代基因測(cè)序(NGS)技術(shù)的廣泛應(yīng)用,使基因檢測(cè)成本降低、時(shí)間減少,然而如何從眾多方法中選擇適宜的基因檢測(cè)方法成為臨床醫(yī)師面臨的新挑戰(zhàn),本文擬對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)單基因遺傳病基因診斷策略和問題進(jìn)行綜述.

一、傳統(tǒng)基因檢測(cè)技術(shù)的合理選擇

傳統(tǒng)基因檢測(cè)技術(shù)根據(jù)臨床表型特征,對(duì)候選基因逐個(gè)排查,檢測(cè)成本高且檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),二代基因測(cè)序技術(shù)可以顯著降低檢測(cè)成本、減少檢測(cè)時(shí)間,尤其對(duì)于種類眾多的致病基因.然而對(duì)于某些單基因遺傳病,靶向單基因檢測(cè)仍作為首選,這些疾病一般具有如下特征:(1)臨床特征明顯,可以結(jié)合血液生化、影像學(xué)等輔助檢查明確診斷;家族史明確;確定為單基因致病性突變[1].臨床明確診斷后,單基因檢測(cè)陽(yáng)性檢出率較高,如ATP7B基因突變導(dǎo)致的肝豆?fàn)詈俗冃訹HLD,亦稱Wilson病(WD)]和DMD基因突變導(dǎo)致的Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(DMD).2016年,Dong等[2]報(bào)告大樣本肝豆?fàn)詈俗冃圆±腁TP7B基因檢測(cè)結(jié)果,90.03%患者(569/632)存在2種或以上病理性或可能病理性變異,其中93.85%(534/569)存在14種最常見病理性變異中至少1種,可見單基因檢測(cè)對(duì)肝豆?fàn)詈俗冃缘臋z測(cè)效率較高.(2)目前尚有部分遺傳性疾病不適宜二代基因測(cè)序,如三核苷酸重復(fù)突變導(dǎo)致的疾病、亨廷頓病(HD)、部分脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)(SCA)、脆性X染色體綜合征(FXS)等;較大缺失或重復(fù)突變導(dǎo)致的疾病如Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、脊髓性肌萎縮癥(SMA)、腓骨肌萎縮癥1A型(CMT1A型)等;基因不明確需特殊檢測(cè),如面?肩?肱型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(FSHD)等.

選擇傳統(tǒng)基因檢測(cè)要求臨床醫(yī)師必須具備充足的特殊基因突變致臨床表型的相關(guān)知識(shí)和豐富的臨床經(jīng)驗(yàn),以及作出正確診斷,極具挑戰(zhàn)性.以腓骨肌萎縮癥為例,包括PMP22基因在內(nèi)的長(zhǎng)度為1.50 Mb串聯(lián)重復(fù)突變導(dǎo)致的CMT1A型是最常見類型,占40%～50%,約70%常染色體顯性遺傳性CMT1型和90%散發(fā)性CMT1型為CMT1A型[3].Saporta等[4]研究顯示,英國(guó)和美國(guó)CMT1型患者PMP22基因突變陽(yáng)性檢出率均超過70%,特別是具有典型臨床癥狀且正中神經(jīng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(NCV)為15～35 m/s的CMT1型患者,PMP22基因突變陽(yáng)性檢出率高達(dá)89%,因此,對(duì)于正中神經(jīng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度為15～35 m/s的CMT1型患者,應(yīng)首選PMP22基因檢測(cè),若呈陰性再行其他靶向基因測(cè)序.但是由于臨床醫(yī)師和電生理學(xué)醫(yī)師存在技術(shù)差異,準(zhǔn)確分型成為難點(diǎn),若PMP22基因呈陰性,再進(jìn)一步行靶向基因測(cè)序套餐檢測(cè),檢測(cè)成本可能更高、檢測(cè)時(shí)間可能更長(zhǎng)[4],因此,對(duì)于經(jīng)驗(yàn)不足的臨床醫(yī)師和某些難以臨床診斷的病例,應(yīng)直接選擇二代基因測(cè)序技術(shù)更為便捷.

二、基于二代基因測(cè)序的目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序

二代基因測(cè)序是一種高通量測(cè)序技術(shù),一次運(yùn)行即可產(chǎn)生數(shù)以億計(jì)的短片段序列,顯著縮短大規(guī)?；驕y(cè)序時(shí)間.通過一系列寡核苷酸探針與全基因組DNA雜交,將基因組特定區(qū)域富集,同時(shí)進(jìn)行二代基因測(cè)序,是目前應(yīng)用最廣泛的目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序技術(shù).通過檢索數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn),篩選出某個(gè)臨床表型的所有相關(guān)致病基因,針對(duì)各目標(biāo)基因外顯子區(qū)域進(jìn)行基因測(cè)序,可以涵蓋與個(gè)體臨床表型相關(guān)的大部分變異.從傳統(tǒng)基因檢測(cè)一次僅能檢測(cè)一種基因到二代基因測(cè)序檢測(cè)一個(gè)基因組(panel),不僅降低檢測(cè)成本、節(jié)省檢測(cè)時(shí)間、提高DNA診斷敏感性,而且簡(jiǎn)化臨床醫(yī)師選擇基因檢測(cè)的策略.關(guān)于基因組的選擇,首先,確定與疾病有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性、有充足的解讀依據(jù),且已作為單基因檢測(cè);其次,將臨床表型重疊但致病基因不同的一組疾病進(jìn)行基因組檢測(cè),可資鑒別診斷[1].與全基因組測(cè)序(WGS)和全外顯子測(cè)序(WES)相比,目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序更加簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì),成為目前臨床基因檢測(cè)的重心,廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病的基因檢測(cè).

1.腓骨肌萎縮癥 亦稱遺傳性運(yùn)動(dòng)感覺神經(jīng)病(HMSN),是基因型和臨床表型異質(zhì)性較強(qiáng)的周圍神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病,致病基因50余種,存在多種遺傳方式.既往推薦的基因診斷策略主要是根據(jù)臨床表型和遺傳方式再結(jié)合基因突變頻率選擇相應(yīng)基因檢測(cè)[5].PMP22基因突變導(dǎo)致的CMT1A型是腓骨肌萎縮癥的最常見亞型(占40%～50%),其次是MPZ基因點(diǎn)突變導(dǎo)致的CMT1B型(占3%～5%)[6],而絕大多數(shù)X連鎖遺傳性腓骨肌萎縮癥為GJB1基因突變所致,是第2位常見亞型(占7%～12%),因此,對(duì)于常染色體顯性遺傳性CMT1型和散發(fā)性CMT1型患者,首先檢測(cè)PMP22基因大片段重復(fù)突變,若呈陰性且家系中無男男遺傳,則考慮CMTX1型并檢測(cè)GJB1基因,若呈陰性,則行MPZ和PMP22基因點(diǎn)突變分析,若仍呈陰性且條件允許,則進(jìn)一步行常染色體顯性遺傳性CMT1型其他致病基因如SJMPLE、EGR2、NFL突變分析.由于腓骨肌萎縮癥的遺傳異質(zhì)性,傳統(tǒng)基因檢測(cè)效率較低;隨著二代基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和檢測(cè)成本的降低,通過目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序技術(shù)可以進(jìn)行基因組檢測(cè),通常將各致病基因外顯子和側(cè)翼序列作為目標(biāo)序列同時(shí)檢測(cè),既降低檢測(cè)費(fèi)用,又保證絕大部分致病基因的陽(yáng)性檢出率,而且也減少意義不明的基因突變分析.其缺點(diǎn)是與全基因組測(cè)序和全外顯子測(cè)序相比,無法發(fā)現(xiàn)新的致病基因.

2.遺傳性痙攣性截癱 遺傳性痙攣性截癱(HSP)是較罕見的具有高度臨床異質(zhì)性和遺傳異質(zhì)性的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病,除表現(xiàn)為雙下肢痙攣性截癱的上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損害外,還可以合并多種神經(jīng)系統(tǒng)及其他系統(tǒng)損害,且與某些神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病的臨床表現(xiàn)相重疊,因此,即使是臨床經(jīng)驗(yàn)豐富的神經(jīng)科醫(yī)師也難以鑒別診斷.目前已克隆的基因有70余種,逐一檢測(cè),選擇困難且耗時(shí)、費(fèi)力.SPG4型是西方國(guó)家最常見的遺傳性痙攣性截癱亞型,系SPASTIN基因突變所致[7],占40%以上,其次是ATL1基因突變導(dǎo)致的SPG3A型[8],再次是REEP1基因突變導(dǎo)致的SPG31型[9],均為常染色體顯性遺傳;而SPG11型、SPG7型和SPG5型是最常見的常染色體隱性遺傳亞型[10],其中,SPG7型表現(xiàn)為突出的小腦癥狀,SPG5型為單純型遺傳性痙攣性截癱,SPG11型為單純型遺傳性痙攣性截癱伴胼胝體變薄.因此,對(duì)于常染色體顯性遺傳家系,應(yīng)依次檢測(cè)SPG4、SPG3A和SPG31基因;對(duì)于常染色體隱性遺傳家系,應(yīng)結(jié)合臨床癥狀,檢測(cè)SPG11、SPG7和SPG5基因;對(duì)于散發(fā)性或家族史不明確的患者,應(yīng)優(yōu)先檢測(cè)SPG4和SPG5基因[11].二代基因測(cè)序技術(shù)可以同時(shí)對(duì)多個(gè)甚至所有已知的遺傳性痙攣性截癱致病基因進(jìn)行檢測(cè),顯著優(yōu)化基因檢測(cè)策略.2013年,Kumar等[12]采用目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序?qū)?7例SPG4基因陰性的遺傳性痙攣性截癱患者進(jìn)行10種常染色體隱性和9種常染色體顯性致病基因檢測(cè),發(fā)現(xiàn)7例(25.93%)呈陽(yáng)性結(jié)果.Balicza等[13]采用目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序結(jié)合全外顯子測(cè)序?qū)?8個(gè)遺傳性痙攣性截癱家系的先證者進(jìn)行基因檢測(cè),結(jié)果顯示,20例(34.48%)明確診斷.Koutsis等[14]對(duì)1例遺傳性痙攣性截癱患者進(jìn)行2731種已知基因檢測(cè),發(fā)現(xiàn)1種新的致病基因--ABCD1基因.根據(jù)目前的技術(shù)條件,從經(jīng)濟(jì)角度考慮可以先檢測(cè)SPG4基因,若呈陰性,再采用二代基因測(cè)序技術(shù)進(jìn)行其余基因檢測(cè),若仍呈陰性,則可以考慮行所有致病基因目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序或全外顯子測(cè)序.

3.原發(fā)性肌張力障礙 原發(fā)性肌張力障礙是單基因遺傳病,目前文獻(xiàn)報(bào)道有27種肌張力障礙基因位點(diǎn),即DYT1～27型.不同基因型致病機(jī)制不同,治療效果也不盡相同,因此,通過基因檢測(cè)確定基因型十分重要.既往通常根據(jù)臨床特點(diǎn)選擇基因,如DYT1型于兒童期或青春期發(fā)病,肌張力障礙逐漸自單側(cè)肢體進(jìn)展至全身;DYT5型為多巴反應(yīng)性肌張力障礙(DRD),表現(xiàn)為晨輕暮重,對(duì)左旋多巴反應(yīng)極佳;DYT8～10型為發(fā)作性肌張力障礙,其中DYT10型抗癲藥物(AEDs)治療有效.隨著二代基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,基因診斷更加簡(jiǎn)便、直接,并且在發(fā)現(xiàn)新的致病基因和致病性突變中發(fā)揮重要作用,Fuchs等[15]采用全外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)DYT25型致病基因?yàn)镚NAL基因;隨后Zech等[16]采用該項(xiàng)技術(shù)發(fā)現(xiàn)DYT27型致病基因?yàn)镃OL6A3基因.如果根據(jù)某種特定臨床表型檢測(cè)相關(guān)基因后未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果,可以選擇目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序?qū)λ幸阎蜻M(jìn)行檢測(cè).值得注意的是,對(duì)于原發(fā)性肌張力障礙,應(yīng)嚴(yán)格把握基因檢測(cè)指征,首先確定為肌張力障礙,其次排除繼發(fā)性肌張力障礙,這是由于其他因素如藥物不良反應(yīng)、毒物毒性作用及其他遺傳性疾病也可以引起肌張力障礙,如肝豆?fàn)詈俗冃?進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序前,若患者存在特定臨床表型,可以選擇相應(yīng)診斷性治療方法,如左旋多巴對(duì)多巴反應(yīng)性肌張力障礙有戲劇性改善效果,卡馬西平對(duì)發(fā)作性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙(PKD)有顯著療效.如果上述診斷性治療方法仍不能明確診斷或無助于篩選候選基因,則可以考慮采用目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序?qū)λ蠨YT基因進(jìn)行檢測(cè).

4.遺傳性肌病 遺傳性肌病具有高度臨床異質(zhì)性和遺傳異質(zhì)性,主要包括肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、先天性肌病、代謝性肌病、神經(jīng)?肌肉接頭病和離子通道病等,臨床表現(xiàn)復(fù)雜且常重疊,相關(guān)致病基因種類眾多,且部分基因較大、外顯子較多、致病性突變位點(diǎn)繁多.盡管肌肉病理學(xué)檢測(cè)有助于候選基因的選擇,但技術(shù)要求高且費(fèi)用昂貴,常不能滿足診斷需求.傳統(tǒng)基因檢測(cè)需根據(jù)臨床表型逐個(gè)檢測(cè)候選基因,耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高,因此,遺傳性肌病整體基因診斷率較低.目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序技術(shù)的高通量、高選擇性、低成本優(yōu)點(diǎn)對(duì)遺傳性肌病的分子診斷具有明顯優(yōu)勢(shì).2015年,傅曉娜等[17]采用目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序?qū)?34例遺傳性肌病患兒進(jìn)行125種相關(guān)基因檢測(cè),74例確定致病性突變,陽(yáng)性檢出率達(dá)55.22%,包括代謝性肌病、先天性肌病、Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、Emery?Dreifuss肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(EDMD)、先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(CMD)、抗肌萎縮蛋白病、肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(LGMD)等,其中先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥包括先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥1A型(MDC1A型)、Ullrich型先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(UCMD)、Bethlem肌病、核纖層蛋白相關(guān)先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥等.Tian等[18]采用目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序技術(shù)對(duì)35個(gè)肌病家系進(jìn)行238種相關(guān)基因檢測(cè),包括代謝性肌病、先天性肌無力綜合征、先天性肌病、先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、先天性肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病(MND)、腓骨肌萎縮癥等,21個(gè)家系(60%)存在臨床表型?基因型相匹配的致病性突變,8個(gè)家系(22.86%)存在可疑致病性突變.2016年,Kuhn等[19]對(duì)58例擬診肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥但無法臨床分型的患者進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序,包括23種LGMD基因和15種導(dǎo)致近似表型的基因,19例(76%)明確診斷.上述研究結(jié)果提示,當(dāng)特異性臨床表型足以指向某一具體疾病或基因時(shí),應(yīng)首先選擇特定基因診斷,例如,Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥通常于幼年發(fā)病,腓腸肌肥大,血清肌酸激酶(CK)水平明顯升高,肌肉病理學(xué)顯示抗肌萎縮蛋白(dystrophin)表達(dá)缺失,均支持診斷,此時(shí)可以直接行DMD基因檢測(cè)而不必要行基因組檢測(cè).如果臨床表型提示為一組疾病,如肢帶肌和四肢近端肌無力和肌萎縮,血清肌酸激酶、肌電圖和肌肉組織活檢提示肌源性損害,臨床疑診肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥,可以考慮行LGMD基因組檢測(cè),如果不能準(zhǔn)確分型,則可以考慮目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序檢測(cè)所有相似表型的基因,較逐一檢測(cè)成本低、時(shí)間短.

三、全外顯子測(cè)序或全基因組測(cè)序

高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和檢測(cè)成本的降低,使全外顯子測(cè)序和全基因組測(cè)序在神經(jīng)內(nèi)科臨床和科研中得到廣泛應(yīng)用.全外顯子測(cè)序系通過序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域靶向捕獲并富集,再進(jìn)行高通量測(cè)序的基因組分析方法[20].人類基因組約含3X109個(gè)堿基對(duì),其中僅1%～2%DNA序列編碼蛋白質(zhì),約85%的遺傳變異集中于蛋白編碼區(qū),即外顯子.因此,全外顯子測(cè)序可以確定大多數(shù)罕見神經(jīng)系統(tǒng)疾病的致病基因[21].全基因組測(cè)序可以獲得非編碼區(qū)信息,是對(duì)全外顯子測(cè)序的重要補(bǔ)充,但檢測(cè)成本較高,而且由于涉及大量非編碼序列,信息量較大、基因分析較復(fù)雜[22].

對(duì)于單基因遺傳病,特別是能夠通過單個(gè)基因或基因組明確診斷的疾病,采用全外顯子測(cè)序甚至全基因組測(cè)序,一方面耗費(fèi)人力和物力,另一方面不能保證足夠的測(cè)序深度和廣度,使測(cè)序敏感性下降.例如,對(duì)于有明確家族史的共濟(jì)失調(diào)患者,基因組檢測(cè)即可檢出常見基因突變,僅當(dāng)基因組檢測(cè)呈陰性時(shí),方啟動(dòng)全外顯子測(cè)序,此時(shí)有可能發(fā)現(xiàn)新的基因突變位點(diǎn),如SCA35型致病基因TGM6基因[23].因此,臨床表型難以確定某一基因組的疾病;存在多系統(tǒng)癥狀的疾病,如伴共濟(jì)失調(diào)的痙攣性截癱(痙攣性截癱基因組檢測(cè)呈陰性);經(jīng)常規(guī)基因檢測(cè)或表型相關(guān)基因組檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)基因突變而臨床表型高度提示單基因遺傳病,方啟動(dòng)全外顯子測(cè)序或全基因組測(cè)序[1].值得注意的是,由于捕獲效能的原因,無論是全外顯子測(cè)序還是全基因組測(cè)序均無法覆蓋全部外顯子和基因組,因此應(yīng)檢測(cè)單核苷酸變異或長(zhǎng)度不超過8～10 bp的多核苷酸變異,而不應(yīng)檢測(cè)致病性重復(fù)序列或長(zhǎng)片段缺失.鑒于此,臨床醫(yī)師在制定全外顯子測(cè)序和(或)全基因組測(cè)序前,應(yīng)首先仔細(xì)分析家族史,明確核心癥候群,再?gòu)V泛查閱相關(guān)文獻(xiàn),謹(jǐn)慎決定[20].通常有25%～60%進(jìn)行全外顯子測(cè)序的患者能夠確定致病基因[20,24],然而,測(cè)序的同時(shí)可以產(chǎn)生大量不確定的基因突變,對(duì)其致病性的解讀應(yīng)嚴(yán)格按照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)與指南[25].還應(yīng)注意的是,基因檢測(cè)結(jié)果的解讀是動(dòng)態(tài)發(fā)展的,隨著科學(xué)知識(shí)的積累,數(shù)據(jù)意義常發(fā)生變化,因此,對(duì)于關(guān)鍵的候選致病基因,嚴(yán)密的功能學(xué)試驗(yàn)有助于確定其致病性并尋找適宜的干預(yù)措施.

全外顯子測(cè)序和(或)全基因組測(cè)序的應(yīng)用可以顯著加速發(fā)現(xiàn)疾病新基因的進(jìn)程,但測(cè)序策略的合理選擇是篩查致病基因的重要保障.對(duì)于常染色體隱性遺傳性疾病,分析基因檢測(cè)結(jié)果時(shí)應(yīng)首先考慮純合突變和復(fù)合雜合突變;對(duì)于常染色體顯性遺傳性疾病,全外顯子測(cè)序常檢測(cè)到大量候選雜合突變,故應(yīng)結(jié)合多種策略進(jìn)一步確定致病性突變.當(dāng)疾病基因異質(zhì)性明顯時(shí),基因檢測(cè)策略即顯得更加重要.篩查家族性帕金森病致病基因時(shí),常通過大家系或數(shù)目眾多的正常對(duì)照確定可能的致病基因,如VPS35和DNAJC13基因[26?27].在無足夠大家系的情況下,Farlow等[28]設(shè)計(jì)兩階段研究方案,包括1個(gè)擁有32個(gè)帕金森病家系93例帕金森病患者的發(fā)現(xiàn)組和1個(gè)擁有49例帕金森病患者的重復(fù)組,進(jìn)行全外顯子測(cè)序,結(jié)果顯示,發(fā)現(xiàn)組患者TNK2和TNR基因的可能致病性突變亦見于重復(fù)組;發(fā)生上述突變的12個(gè)家系中TNK2和TNR基因共檢出9種變異,均經(jīng)Sanger測(cè)序證實(shí)可能是帕金森病新的可疑致病性突變.

高通量測(cè)序技術(shù)的推廣必將加速罕見病新的致病基因的發(fā)現(xiàn),同時(shí)也將帶來新的問題和挑戰(zhàn):(1)全外顯子測(cè)序可以縮短病因篩查過程,但在絕大多數(shù)情況下,尋找到致病性突變并不意味治愈患者.(2)全外顯子測(cè)序有時(shí)可以意外發(fā)現(xiàn)與主要疾病無關(guān)的致病性突變,此時(shí)臨床醫(yī)師應(yīng)根據(jù)臨床需求進(jìn)行醫(yī)療監(jiān)控,甚至啟動(dòng)必要的治療措施.(3)全外顯子測(cè)序并未覆蓋全部基因組序列,即使呈陰性結(jié)果也不能完全排除某種遺傳學(xué)病因.因此,當(dāng)基因檢測(cè)得不到確定結(jié)論時(shí),臨床醫(yī)師和遺傳咨詢師有責(zé)任幫助患者及其家屬正確看待檢測(cè)結(jié)果[29?30].

四、染色體微陣列分析

染色體微陣列分析(CMA)技術(shù)可以檢測(cè)人類基因組DNA重復(fù)和缺失的拷貝數(shù)變異(CNV),是一種分子核型分析技術(shù),可以檢出核型分析檢測(cè)不到的基因組微缺失或微重復(fù)變異.根據(jù)芯片設(shè)計(jì)與檢測(cè)原理的不同,染色體微陣列分析技術(shù)可以分為兩種類型:基于微陣列的比較基因組雜交(aCGH)技術(shù)和單核苷酸多態(tài)性微陣列(SNP array)技術(shù)[31],主要用于檢測(cè)大片段缺失和重復(fù),適用于孤獨(dú)癥譜系障礙(ASDs)、兒童精神發(fā)育遲緩、先天性畸形等.

染色體微陣列分析技術(shù)應(yīng)用前,兒童精神發(fā)育遲緩和先天性畸形的病因診斷是臨床醫(yī)師的難題,近10年來其診斷率有所提高.Sagoo等[32]的Meta分析顯示,13 926例經(jīng)核型分析無異常的精神發(fā)育遲緩和先天性畸形患兒中約10%經(jīng)染色體微陣列分析檢出致病性突變.袁海明等[33]對(duì)2000例先天性缺陷(包括智力低下、發(fā)育遲緩、多發(fā)性畸形、自閉癥、癲等)患兒進(jìn)行染色體微陣列分析,陽(yáng)性檢出率達(dá)26.10%(522/2000).Roberts等[34]對(duì)215例孤獨(dú)癥、孤獨(dú)癥譜系障礙、發(fā)育遲緩或?qū)W習(xí)障礙患者分別進(jìn)行包含105X103和180X103個(gè)探針的寡核苷酸微陣列分析,結(jié)果顯示,45例(20.93%)拷貝數(shù)變異,包括49種,其中32種確定為致病性拷貝數(shù)變異,余17種臨床意義不明.Schaefer等[35]對(duì)68例孤獨(dú)癥患兒進(jìn)行染色體微陣列分析,拷貝數(shù)變異陽(yáng)性檢出率為20.59%(14/68).文獻(xiàn)報(bào)道的染色體微陣列分析對(duì)孤獨(dú)癥和學(xué)習(xí)障礙的陽(yáng)性檢出率高于核型分析和脆性染色體檢測(cè).Michelson等[36]總結(jié)1980-2009年的7000篇文獻(xiàn)采用不同檢測(cè)方法對(duì)全面性發(fā)育遲緩(GDD)和智力障礙患兒的陽(yáng)性檢出率,染色體微陣列分析為7.8%,G顯帶核型分析為4%,亞端粒熒光原位雜交(FISH)為3.5%;約10%患兒系X連鎖基因突變所致,其中在有確切X連鎖家族史的男性患兒中約42%可以檢出X連鎖基因突變,例如,2%輕至中度智力障礙患兒可以檢出FMR1基因全擴(kuò)增,1.5%中至重度全面性發(fā)育遲緩或智力障礙女性患兒可以檢出與Rett綜合征相關(guān)的MeCP2基因突變.染色體微陣列分析可以用于特發(fā)性全面性癲的遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià).特發(fā)性全面性癲約占所有癲的30%,雖然預(yù)測(cè)與遺傳因素有關(guān),但絕大多數(shù)未檢出致病基因.研究顯示,有1.0%～1.3%單純特發(fā)性全面性癲患兒(排除孤獨(dú)癥、情感障礙和嚴(yán)重智力障礙)可以檢出15q13.3區(qū)域CHRNA7基因缺失,該突變與智力障礙、孤獨(dú)癥和精神分裂癥有關(guān)[37?38].染色體微陣列分析還可以用于其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià),Shoichet等[39]采用基于微陣列的比較基因組雜交技術(shù)檢測(cè)72例散發(fā)性肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)患者,檢出11種長(zhǎng)度<1 Mb的變異(包括重復(fù)突變6種、缺失突變5種),其中5種僅見于肌萎縮側(cè)索硬化癥患者,提示拷貝數(shù)變異可能是肌萎縮側(cè)索硬化癥易感性的候選病因.

然而,染色體微陣列分析的適應(yīng)癥主要是精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩、自閉癥、多發(fā)性畸形等,且臨床表型多樣的陽(yáng)性檢出率遠(yuǎn)高于單一臨床表型[33].除適應(yīng)證外,該項(xiàng)技術(shù)還存在一定局限性,不能檢出染色體平衡易位,不能檢出點(diǎn)突變和重復(fù)突變等,因此,對(duì)于染色體微陣列分析呈陰性的患者還應(yīng)行核型分析、原位熒光雜交或點(diǎn)突變和重復(fù)突變檢測(cè).

綜上所述,對(duì)于臨床醫(yī)師而言,臨床表型是首先獲得的信息,臨床表型和基因型異質(zhì)性使致病基因的篩選變得復(fù)雜.對(duì)于某些特征性臨床癥狀,能夠直接指向某一具體疾病和基因,不建議進(jìn)行大范圍基因檢測(cè),而是首先選擇單一基因檢測(cè);某種臨床表型涉及的基因達(dá)數(shù)種、數(shù)十種甚至數(shù)百種,而已知致病基因的臨床表型也有多種,可能存在未發(fā)現(xiàn)但與該基因相關(guān)的臨床表型,建議選擇目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序?qū)ο嚓P(guān)基因進(jìn)行篩查.在進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果解讀時(shí),是否為致病性突變位點(diǎn)、基因突變是否與臨床表型一致,臨床醫(yī)師不能依賴基因檢測(cè)機(jī)構(gòu)的結(jié)論,必須對(duì)臨床表型和基因型的相關(guān)性具備一定識(shí)別能力,要有自己的判斷.此外,盡管人類基因組遺傳多態(tài)性和致病性突變數(shù)據(jù)庫(kù)信息不斷豐富,但關(guān)于許多罕見病的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)仍不完善,仍有許多突變位點(diǎn)的致病性尚不確定,二代基因測(cè)序技術(shù)檢出基因突變及其位點(diǎn)較多,但其致病性信息不足,檢測(cè)結(jié)果的判斷不準(zhǔn)確,可能使部分患者不能明確診斷.因此,基因診斷是一個(gè)臨床信息和生物學(xué)信息不斷溝通、不斷更新的過程.

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Strategies and problems of genetic diagnosis for neurogenetic diseases

LI Xun?hua,CHEN Ding?bang,WU Chao
Department of Neurology,the First Affiliated Hospital,Sun Yat?sen University,Guangzhou 510080,Guangdong,China

LI Xun?hua(Email:lxh59xyh@sina.com)

Neurogenetic diseases are difficult to diagnose due to complicated phenotypes.Genetic testing is always the option for final diagnosis.With the progress and update of molecular diagnostic techniques,especially widely usage of next?generation sequencing(NGS),choosing proper sequencing methods is a new challenge. This paper aims to review different strategies and problems of genetic diagnosis for monogenic neurogenetic diseases based on clinical phenotypes,gene mutation characteristics and gene sequencing methodology.

Genetic diseases,inborn; Nervous system diseases; Genes; Review

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81171070).

10.3969/j.issn.1672?6731.2017.07.002

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào):81171070)

510080廣州,中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科

李洵樺(Email:lxh59xyh@sina.com)

2017?05?26)