掌握科學(xué)規(guī)律是實施科學(xué)防治的前提
——分子流行病學(xué)技術(shù)在結(jié)核病防治中的應(yīng)用

賀文從 劉東鑫 趙雁林

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·述評·

掌握科學(xué)規(guī)律是實施科學(xué)防治的前提
——分子流行病學(xué)技術(shù)在結(jié)核病防治中的應(yīng)用

賀文從 劉東鑫 趙雁林

科學(xué)防治結(jié)核病的重中之重是了解其分布特征和影響因素，通過掌握其傳播規(guī)律、耐藥機制及有效實施科學(xué)決策下的結(jié)核病控制策略和措施，從而達到控制結(jié)核病的目的。然而由于結(jié)核分枝桿菌(MTB)潛伏感染、耐藥產(chǎn)生等因素，傳統(tǒng)的流行病學(xué)方法不能很好地揭示其傳播流行規(guī)律。結(jié)核分子流行病學(xué)以基因分型技術(shù)為基礎(chǔ)，將傳統(tǒng)流行病學(xué)與新興的生物技術(shù)相結(jié)合，從分子水平來闡明結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展、流行、耐藥產(chǎn)生及傳播規(guī)律。分子流行病學(xué)在結(jié)核病暴發(fā)流行的調(diào)查、近期傳播的追蹤、菌株多樣性的研究、內(nèi)源性復(fù)燃和外源性再感染的區(qū)分、耐藥機制及傳播等研究中的優(yōu)勢顯著[1]，為制訂有效的結(jié)核病控制策略提供了理論基礎(chǔ)。

目前，應(yīng)用于MTB研究的分子流行病學(xué)方法主要有以下5種：(1)基于MTB散在分布重復(fù)單位-數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列的分型方法(MIRU-VNTR)；(2)間隔區(qū)寡核苷酸分型法(Spoligotyping)；(3)插入序列6110(IS6110)限制性片段長度多態(tài)性分型方法(IS6110-RFLP)；(4)單核苷酸多態(tài)性分型技術(shù)(SNP)；(5)全基因組測序(WGS)技術(shù)。現(xiàn)將各種方法的原理、優(yōu)缺點及應(yīng)用闡述如下，以擴大分子流行病學(xué)方法在結(jié)核病防治方面的應(yīng)用。

一、MIRU-VNTR分型方法

MTB染色體中存在很多包含分枝桿菌重復(fù)單位(MIRUs)的位點，每一位點包括1～12個首尾相連的完全相同或者有輕微差別的重復(fù)序列。MIRU-VNTR分型方法是對多個相互獨立的MIRU位點進行PCR擴增，然后PCR產(chǎn)物和MIRU marker同時跑電泳，根據(jù)電泳圖與marker的比較，判斷每個位點的拷貝數(shù)，從而為每一株菌建立一組由多個數(shù)字組成的MIRU“身份證號碼”。此方法在辨別IS6110拷貝數(shù)很低(<6個)的分離株時非常有效，且分辨率要高于IS6110-RFLP和Spoligotyping單獨分型[2]，隨著MIRU-VNTR基因分型所用重復(fù)序列的增多，分型能力也逐漸增強。目前，國際上應(yīng)用較多的分辨率最高的3種VNTR位點組合是最早的第12位點，歐洲的第15位點和美國推薦的第24位點。李墨等[3]曾對72株北京地區(qū)分離的北京基因型MTB菌株的24個VNTR位點進行分析，證明不同VNTR位點組合(第12位點、第15位點、第24位點)在北京基因型菌株中的分辨指數(shù)依次升高，分別為0.788、0.990、0.992。由于第15位點的分辨指數(shù)與第24位點的分辨指數(shù)基本相同，我國主要采用基礎(chǔ)的VNTR15位點作為MTB分子流行病學(xué)研究的一線方法[4-5]。

MIRU分型基于PCR，實驗操作較為簡單、分辨率高、所需的DNA量較少、結(jié)果可重復(fù)性好，且數(shù)字化的結(jié)果易于實驗室間的比較。隨著基因分析儀器的使用，MIRU分型能夠自動化，更加簡便快速，可以對大量MTB菌株進行分型，最重要的是可以區(qū)分混合感染。MIRU-VNTR分型方法是目前最有吸引力的MTB分型方法，并且應(yīng)用也最廣泛。但VNTR分型方法本身具有非同源相似性的缺陷，對于特定的位點組合，不同種系的菌株可能有相同的型別，因此先利用SNP和長序列多態(tài)性(LSP)進行譜系定義，再用VNTR進行分型是目前MTB基因分型的一種高效策略。

二、Spoligotyping分型方法

Spoligotyping分型方法是根據(jù)特異存在于MTB復(fù)合群的且具有多態(tài)性的直接重復(fù)(direct repeat，DR)區(qū)而構(gòu)建的，通過比較各菌株的DR區(qū)，以發(fā)現(xiàn)間隔區(qū)和DR 區(qū)的(染色體)中間缺失和(或)插入。該方法針對目前發(fā)現(xiàn)的多種不同的間隔序列，設(shè)計各自特異的寡核苷酸探針，并將探針固定在尼龍膜上，引物預(yù)先用生物素等標(biāo)記，擴增產(chǎn)物與膜上的探針進行反向雜交，然后通過增強化學(xué)發(fā)光試劑盒進行檢測。由于不同菌株的間隔序列不同，最終各自雜交的探針數(shù)量和種類也會不同。目前，Spoligotyping主要根據(jù)43個位于直接重復(fù)區(qū)域中間隔序列的存在與缺失對菌株進行分子分型。Spoligotyping 分型商業(yè)化試劑盒較多，只需幾個小時就可以完成，并且可以與數(shù)據(jù)庫SploDB4及SITVIT-WEB國際多位點遺傳標(biāo)志物數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行對比，非常簡單快速，而且重復(fù)性高。Spoligotyping是經(jīng)典的MTB分型方法，該技術(shù)最大的優(yōu)點是可以對MTB進一步分型到亞種水平，對含有IS6110拷貝數(shù)較少的菌株分辨率較高，可以進一步鑒定IS6110-RFLP分型不能鑒定的菌株，但是該方法單獨使用時分辨能力較低，Liu等[6]對1585株菌進行分析，Spoligotyping的Hunter-Gaston分辨率指數(shù)(HGDI)為0.399，對北京家族菌株分辨率更低，當(dāng)與MIRU-VNTR分型方法聯(lián)合使用時分辨率高達99.89%。

Spoligotyping方法鑒定北京家族菌株快速、簡單、操作可重復(fù)性高，但分辨率較低，尤其不能區(qū)分不同的北京基因型菌株，且不能識別復(fù)合感染。目前多與IS6110-RFLP或MIRU-VNTR聯(lián)合使用，并且這種組合已在世界各個國家廣泛使用[7-8]。

三、IS6110-RFLP分型方法

IS6110是MTB基因中最常見的IS序列，是一段自然發(fā)生的轉(zhuǎn)座序列，屬于IS3家族，也是目前研究比較清楚的IS序列。不同菌株中，IS6110的拷貝數(shù)變化很大，從0個到超過25個，這種差別是利用IS6110進行菌型鑒定的基礎(chǔ)。根據(jù)MTB基因組中存在插入序列IS6110的數(shù)目及位置不同，利用限制性內(nèi)切酶PvuⅡ來切割I(lǐng)S6110上相應(yīng)位點進行消化，經(jīng)過電泳分離，可以得到類似指紋樣的特征性條帶，這些條帶稱為IS6110-RFLP DNA指紋。IS6110-RFLP方法是一種經(jīng)典的MTB分型方法，使用廣泛并且分辨率高。印度Mathuria與Anupurba[9]曾利用IS6110-RFLP方法對26株MTB分離株進行分析，發(fā)現(xiàn)26株菌中2株(7.8%)為0拷貝，3株(11.5%)為低拷貝，21株(80.8%)為多拷貝，表現(xiàn)出多種型別，這說明對于印度分離株，IS6110-RFLP仍然是一種有前途的分型方法并且擁有較高的分辨率。而Liébana等[10]對339株MTB進行IS6110-RFLP分析，高達35株未見IS6110序列PCR條譜，使鑒定難以進行，這說明應(yīng)用IS6110-RFLP進行分型，實驗結(jié)果差異較大。

雖然IS6110-RFLP方法具有較高的分辨率并且特異性較強，但是自身的局限性也較大，如不適用拷貝過低或者過高菌株的分型、需要的樣本量多、操作復(fù)雜、實驗結(jié)果差異性較大、重復(fù)性差等，這些都限制了這種經(jīng)典分型方法的發(fā)展，隨著其他分型方法的發(fā)展，IS6110-RFLP在MTB分子分型中的應(yīng)用會越來越少。

四、SNP 分析技術(shù)

SNP主要是指基因組水平上由于單個核苷酸變異引起的基因組DNA序列多態(tài)性，包括堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失。SNP的鑒定方法主要分為兩大類：一類是測序相關(guān)方法，主要包括全基因組測序和目的片段測序；另一類是基于PCR擴增的非DNA測序方法，如實時定量PCR和基因芯片等。利用各種技術(shù)確定的SNP被廣泛應(yīng)用于菌種鑒定、藥物敏感性試驗、菌株分型及進化分析和流行病學(xué)檢測等。MTB耐藥性的產(chǎn)生多由基因的突變導(dǎo)致，耐藥性相關(guān)基因的SNP檢測已經(jīng)成為MTB藥物敏感性試驗的重要手段[11]，如MTB對異煙肼耐藥相關(guān)的SNP主要發(fā)生在katG、inhA等基因中。有研究表明，katG基因SNP在對異煙肼耐藥菌株中的發(fā)生率達到30%～60%；另外rpoB密碼子的SNP與MTB對利福平高水平的耐藥有關(guān)[12]。Chauhan等[13]研究發(fā)現(xiàn)，牛分枝桿菌和卡介苗(BCG)中narK2X基因啟動子區(qū)域有1個SNP突變，通過檢測這個SNP可快速、準(zhǔn)確地將MTB與MTB復(fù)合群(包括牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌等)區(qū)分開。北京家族菌株被認(rèn)為具有更高的毒力和侵襲力，Homolka等[14]研究認(rèn)為Rv2629等位基因中A191C突變是北京基因型的生物學(xué)標(biāo)志；Alonso等[15]利用該標(biāo)志建立了一種與RT-PCR結(jié)合的高分辨率熔解實驗，可快速區(qū)分北京家族與非北京家族的菌株。許多研究認(rèn)為，MTB基因組SNP可被用來進行進化分析，特別是其中的同義SNP，由于研究認(rèn)為其不受選擇壓力的影響，故被認(rèn)為是進行MTB進化分析的理想生物學(xué)標(biāo)志[16-17]。

就目前的研究現(xiàn)狀來說，基因測序的成本較高，且為保證SNP的高分辨率和代表性需要選擇較多的位點，因此該分型方法對于少量的菌株或者初步分型還是比較實際的。如果對于大量菌株全部進行SNP分型，因為位點太多，測序成本太高，數(shù)據(jù)處理復(fù)雜，不利于推廣使用。但SNP可以克服VNTR同源異性的內(nèi)在缺陷，Luo等[18]采用8個SNP位點結(jié)合VNTR-15的復(fù)合分型方法在一定程度上證明了該論點，同時也說明2種或2種以上分型方法的聯(lián)合使用可以達到較為滿意的結(jié)果。但有研究證明，SNP分型技術(shù)的分辨率并不高，在用于追蹤傳染源和查找傳播途徑等菌株水平的傳統(tǒng)基因分型研究方面較為困難[19]。從嚴(yán)格意義上來說，SNP是基因組水平上另一種多態(tài)性的展示，并不適合用于基因分型研究，但用于耐藥產(chǎn)生和傳播是最好的方法，而在基因分型方法的應(yīng)用方面，該方法可作為補充。Shah等[20]于2011—2014年期間在南非夸祖魯-納塔爾省通過連續(xù)、動態(tài)納入所有在該省常住的新診斷為廣泛耐藥結(jié)核病的患者，并對其社會人口學(xué)信息、MTB和HIV感染史、密切接觸者線索調(diào)查(全球定位系統(tǒng)ArcGIS軟件)，對所有患者的臨床分離株進行RFLP分析和耐藥相關(guān)基因(rpoB、katG、inhA、pncA、gyrA、rpsL、rrs和gidB)測序；對于RFLP差別少于1個，耐藥相關(guān)基因序列完全相同的定義為一個簇，認(rèn)為其是由于傳播造成的；而對于不能成簇或者具有獨特基因型的菌株認(rèn)為其耐藥性的產(chǎn)生是獲得性耐藥。該研究清楚地揭示了在南非夸祖魯-納塔爾省，30%的XDR-TB患者是由于傳播造成，由此認(rèn)為在該地區(qū)造成XDR-TB流行的主要因素可能是傳播，而不是傳統(tǒng)認(rèn)為的不恰當(dāng)治療引起。該研究所應(yīng)用的分子流行病學(xué)方法學(xué)具有標(biāo)桿性的作用，特別是在耐藥性產(chǎn)生及傳播方面。

SNP檢測方法的建立為快速、高效的耐藥性檢測提供了可能，也為MTB的進化研究提供了支持，隨著測序成本的降低及各種技術(shù)的推廣，我們相信對MTB基因組SNP的研究會不斷地深入，該技術(shù)一定會在結(jié)核病、尤其是耐藥結(jié)核病的防控與治療方面提供越來越多的幫助。

五、WGS技術(shù)

WGS技術(shù)能夠全面、精確地分析基因組的堿基序列，從而破解其所包含的信息，揭示基因組的復(fù)雜性、多樣性。隨著測序技術(shù)的飛速發(fā)展，WGS技術(shù)已廣泛應(yīng)用于科研、醫(yī)療和分子流行病學(xué)的研究中。在結(jié)核病防治方面的應(yīng)用主要體現(xiàn)在4個方面：(1)通過測序獲得MTB全基因組序列信息并進行菌種鑒定。Zhou等[21]利用測序得到的基因組序列進行核苷酸等長區(qū)域(1000～10 000 bp)劃分，每個區(qū)域隨機核苷酸字符串(k，1

WGS技術(shù)可以快速全面地獲得菌株的全基因組信息，能夠在基因水平上揭示細菌在傳播過程中的遺傳變異，準(zhǔn)確判斷傳播方向，是系統(tǒng)進化研究的金標(biāo)準(zhǔn)。隨著測序技術(shù)不斷進步，成本不斷下降，WGS將會全面應(yīng)用于MTB的流行病學(xué)監(jiān)測，這將對了解MTB的分子進化、基因組成、基因調(diào)控、耐藥傳播等具有重要意義。但是該項技術(shù)成本較高，并且需要特定的技術(shù)和軟件，這些都限制了WGS的廣泛應(yīng)用。

六、分子流行病學(xué)在結(jié)核病防治中應(yīng)用的展望

由于實驗室條件的限制，目前我國基層實驗室還未能全面開展MTB分子流行病學(xué)研究，致使學(xué)者對我國結(jié)核病的傳播規(guī)律、分布形式及耐藥特征未能有全面的了解。MTB分型手段日趨豐富，分型過程越來越簡單、快速、高效。各種分型技術(shù)或者分子生物學(xué)方法將會應(yīng)用到日常的結(jié)核病監(jiān)測中，MTB種系關(guān)系會逐漸被闡明，菌株生物學(xué)表型與基因型的關(guān)系越來越受到關(guān)注。運用高分辨率的分型方法可更好地將菌株不同的遺傳背景與其不同的毒力和致病力聯(lián)系起來，研究特有基因型菌株的致病性和傳播特征、高致病性菌株的種系發(fā)生和分布特征，了解耐藥結(jié)核病的產(chǎn)生及傳播，這些對于結(jié)核病的防控和治療有著巨大意義。目前，MIRU-VNTR分型的辨識能力與IS6110-RFLP分型技術(shù)相當(dāng)，但較IS6110-RFLP分型技術(shù)的操作簡單，并且MIRU-VNTR分析已經(jīng)自動化。未來一段時間內(nèi)，我國乃至世界上MTB的分型會以MIRU-VNTR分型技術(shù)為主。

隨著二代測序技術(shù)的普及和三代測序技術(shù)的逐步完善，測序有望實現(xiàn)低成本和高效率兼得。未來SNP技術(shù)及WGS技術(shù)將會全面應(yīng)用到對MTB的監(jiān)測及耐藥結(jié)核病產(chǎn)生及傳播的研究中。從片面的基因分型跨入全基因組研究過程中，人類對MTB的耐藥、致病機制和傳播規(guī)律會有更深的認(rèn)識。

作為世界上最大的發(fā)展中國家，我國的結(jié)核病及耐藥結(jié)核病防治形勢都面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，結(jié)核病耐藥率較高，而耐多藥肺結(jié)核致死率高，治愈率低。Zhao等[23]研究表明，我國結(jié)核病患者中總的MDR-TB 發(fā)生率為8.32%， XDR-TB 發(fā)生率為0.68%。提示我們需要進一步加強我國結(jié)核病患者，尤其是MDR-TB患者的管理。引入分子流行病學(xué)技術(shù)，可以確定我國主要流行性菌株的型別，并且可以做好篩查工作，早期篩查出結(jié)核病患者、特別是MDR-TB患者，從而給予患者及早的隔離和治療。分子流行病學(xué)將在研究結(jié)核病易感性、疾病傳播的發(fā)生與傳播、感染與發(fā)病的潛伏期之間的關(guān)系、內(nèi)源性復(fù)發(fā)與外源性再燃的比例、不同菌株是否有不同的病理表現(xiàn)、不同菌株的傳播模式及對抗結(jié)核藥敏感性的差異、混合感染出現(xiàn)的頻率、不同人群中發(fā)病的危險因素、監(jiān)測實驗室檢測錯誤的發(fā)生等方面，在預(yù)防醫(yī)學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、乃至大數(shù)據(jù)分析公共衛(wèi)生事件等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。未來分子流行病學(xué)技術(shù)也將廣泛應(yīng)用于我國結(jié)核病的防治，對于改善我國結(jié)核病及耐藥肺結(jié)核的高發(fā)現(xiàn)狀將有重大幫助。

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(本文編輯：薛愛華)

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.001

102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所(賀文從、劉東鑫)，結(jié)核病預(yù)防控制中心(趙雁林)

趙雁林，Email：zhaoyanlin@chinatb.org

2017-07-18)