甲基丙烯酰胺基明膠水凝膠在關(guān)節(jié)軟骨損傷修復領(lǐng)域中的研究進展

張傳昕 李梁 吳海山

甲基丙烯酰胺基明膠水凝膠在關(guān)節(jié)軟骨損傷修復領(lǐng)域中的研究進展

張傳昕 李梁 吳海山

組織工程；軟骨，關(guān)節(jié)；細胞培養(yǎng)技術(shù)；水凝膠類；損傷，軟骨；甲基丙烯酰胺基明膠水凝膠

關(guān)節(jié)軟骨是一種無血管、神經(jīng)和淋巴腺的組織，其含有的軟骨細胞數(shù)量少且缺乏干細胞[1-2]，因此關(guān)節(jié)軟骨損傷后的自我修復能力有限。在接受關(guān)節(jié)鏡術(shù)的患者中，60% 存在軟骨損傷[3-4]。而軟骨損傷后，大多數(shù)都會進展為骨關(guān)節(jié)炎[2]。目前臨床上針對軟骨損傷的處理方案有以微骨折法為代表的促進修復手術(shù)和以自體軟骨移植或同種異體軟骨移植為代表的軟骨修復手術(shù)，但存在纖維軟骨修復、供體不足、手術(shù)過程復雜、免疫排異等問題，且其遠期療效欠佳[5-8]。

現(xiàn)有技術(shù)的缺陷使研究者轉(zhuǎn)向近年來飛速發(fā)展的組織工程和再生醫(yī)學領(lǐng)域。20年前，Langer 和 Vacanti[9]制訂了組織工程三個基本原則，即分離的細胞或細胞替代物，誘導組織生發(fā)的物質(zhì)以及容納細胞的基質(zhì)。除種子細胞和細胞因子外，支架的性能對軟骨修復有至關(guān)重要的影響?，F(xiàn)有多種結(jié)構(gòu)的支架用于軟骨修復的研究和應用，如纖維支架、水凝膠和微載體納米支架。其中，水凝膠因其具有良好的生物組織相容性、生物降解性和細胞黏附性而受到關(guān)注[10-12]。此外，水凝膠還具有下述特點[11-14]：( 1) 含水量高，與軟骨細胞外基質(zhì)高度相似，有利于營養(yǎng)運輸和細胞代謝；( 2) 可調(diào)控的機械強度，通過對水凝膠的修飾控制其壓縮模量和彈性模量；( 3) 構(gòu)建細胞 3D 培養(yǎng)體系，3D 環(huán)境可使細胞呈圓形或卵圓形，維持軟骨細胞正常表型[15-17]；( 4) 可實現(xiàn)液－固相轉(zhuǎn)換，通過物理或化學方式的催化誘導而改變狀態(tài)。在眾多結(jié)構(gòu)的水凝膠中，甲基丙烯酰胺基明膠水凝膠 ( gelatin methacryloyl hydrogels，GelMA ) 除了具有上述特點外，其易操作、低成本、安全無毒以及廣泛的臨床應用[18]而受到關(guān)注。通過化學或物理交聯(lián)、光聚合或者精細制造技術(shù)[14,19-20]，可以改善水凝膠的物化特性和生物行為?，F(xiàn)將 GelMA 的特性及其在軟骨修復領(lǐng)域的研究進展概述如下。

一、明膠水凝膠的特性

明膠是一種主要由 I 型膠原變性水解而來的蛋白質(zhì)產(chǎn)物[21]，故具有良好的生物降解性和組織相容性，且因成本低廉、易獲得、降解后無毒性[10]被廣泛應用于醫(yī)藥、食品領(lǐng)域，如臨床中的血漿代用品以及疫苗等蛋白制劑的穩(wěn)定劑[22]。與膠原蛋白不同的是，明膠的抗原性由于加熱變性而顯著降低，所以不易引起機體的免疫應答。但其保留了膠原蛋白的細胞黏附特性和基質(zhì)金屬蛋白酶附著位點[23]。因此，明膠基質(zhì)可以促進細胞的遷移、增殖和分化以及引發(fā)細胞介導的酶促降解作用[24]。

為使明膠基水凝膠在體內(nèi)保持穩(wěn)定，預先在其側(cè)基修飾官能團，隨后可利用多種方式將明膠共價交聯(lián)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但只有少數(shù)幾種適合同步交聯(lián)和細胞封裝[25]，如光交聯(lián)和酶促交聯(lián)。與酶促反應相反，光引發(fā)能在時間和空間上控制交聯(lián)過程，這對制備結(jié)構(gòu)復雜的水凝膠至關(guān)重要[26]。紫外線和可見光都可以引發(fā)光交聯(lián)，目前使用最多的為紫外線光敏型明膠。

有多種光引發(fā)劑能夠引發(fā)光交聯(lián)，多數(shù)文獻報道應用光引發(fā)劑 Irgacure 2959配合 GelMA 來啟動交聯(lián)反應。Irgacure 2959屬于裂解型光引發(fā)劑，細胞毒性比其它光引發(fā)劑低，可在紫外光照條件下可以裂解出能夠打開烯類 π鍵的自由基[27]。紫外光波長的大小對于光照交聯(lián)反應的進行十分關(guān)鍵，波長 300nm 的紫外光能量約為 400kJ / mol，與鍵能 120～840kJ / mol 相當，大于一般化學反應的活化能，這是光能引發(fā)聚合的依據(jù)。各類烯類單體都有各自特殊的吸收光區(qū)域，一般為波長 200～300nm 的紫外光區(qū)。但對于光交聯(lián)水凝膠反應中紫外線波長的確定，各文獻的結(jié)果并不一致[28-29]，還需進一步實驗加以論證。

Bartnikowski 等[30]研究光引發(fā)劑濃度和紫外線劑量是否對軟骨細胞有毒性作用，其認為引發(fā)劑的濃度需要根據(jù)活性基團的數(shù)量而定，且不同紫外線劑量對細胞無顯著毒性作用。然而，紫外線對生物體的損傷作用是眾所周知的，盡管細胞活性在短期內(nèi)未受影響，但紫外線損傷依然可能對細胞功能和組織形成存在潛在的長期副作用[31]。其次，光引發(fā)劑 Irgacure 2959對細胞的長期作用也未研究透徹。所以，對可見光交聯(lián)及相應引發(fā)劑的研究是有價值且必要的。

二、GelMA 的特性

為使明膠基水凝膠性質(zhì)進一步優(yōu)化，可修飾不同類型的官能團，如甲基丙烯酸酐等。Van den Bulcke 等[32]在2000年首論述了 GelMA，因其固有的生物活性和可調(diào)控的生化性質(zhì)而受到組織工程領(lǐng)域的青睞[33]。GelMA 由甲基丙烯酸酐在弱堿性環(huán)境 ( pH＝7.5) 中修飾明膠分子鏈上的氨基得到，在 50℃ 的反應溫度下，氨基酸的氨基與酰氯或酸酐在弱堿溶液中發(fā)生作用時，氨基即被?；?，以此交聯(lián)到明膠分子鏈上。

在設(shè)計 GelMA 時，充分考慮其理化特性 ( 如硬度、降解曲線、孔徑大小 ) 和細胞行為 ( 如細胞活性、增殖、分化和遷移 ) 是決定其應用于不同組織工程領(lǐng)域的關(guān)鍵，如改變 GelMA 的修飾度或光交聯(lián)的條件。調(diào)節(jié)甲基丙烯酸酐修飾明膠的濃度，可改變其生化特性，稱為 GelMA 的修飾度[32]。如骨髓間充質(zhì)干細胞的高密度培養(yǎng)有利于細胞向軟骨細胞分化[34]，當 GelMA 的修飾度接近 80% 時，凝膠內(nèi)大分子廣泛的交聯(lián)可以阻礙細胞的擴散，以此促進間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞的分化。修飾度在 20%～80% 的GelMA 可以保持穩(wěn)定的理化性質(zhì)，且隨著修飾度的增高，凝膠硬度和耐久度隨之增高而孔徑則減小[35]。調(diào)整光交聯(lián)的條件對 GelMA 的特性也有顯著影響。這些條件參數(shù)包括曝光時間，光照強度和引發(fā)劑濃度。GelMA 的降解主要由酶促反應引起，尤其是基質(zhì)金屬蛋白酶，通常由封裝在水凝膠中的軟骨細胞分泌，故平衡水凝膠降解速率與基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌量也是需要被深入研究的課題。

GelMA 具有良好的促細胞黏附和增殖特性。先前的研究顯示，由于 GelMA 的生物組織相容性、力學特性及含有多肽序列，在 2D 和 3D 的細胞培養(yǎng)實驗中都能充當培養(yǎng)基使用[36]。如細胞可以在 GelMA 溶液中單層培養(yǎng)，也可以在 GelMA 經(jīng)紫外線光交聯(lián)后構(gòu)建負載細胞的 3D 培養(yǎng)體系，且細胞存活率基本＞80%。而與 2D 單層培養(yǎng)不同的是，3D 水凝膠中的細胞能改變其周圍環(huán)境并使之適于遷移[37]。此外，3D 壞境中細胞行為更接近其在天然組織中的表現(xiàn)，由于 GelMA 與細胞外基質(zhì)高度的相似性，而使之成為細胞 3D 培養(yǎng)體系的研究熱點[38-40]。

三、GelMA 在軟骨損傷修復中的應用

雖然軟骨細胞常用于修復軟骨損傷，但其在單層培養(yǎng)中會發(fā)生去分化現(xiàn)象而限制了其產(chǎn)生透明軟骨的能力?，F(xiàn)在有越來越多的證據(jù)表明，與傳統(tǒng)的細胞單層培養(yǎng)相比，在 3D 環(huán)境中生長的軟骨細胞更能維持自身形態(tài)和表型，3D 體系所模擬的生理環(huán)境使得軟骨細胞能夠產(chǎn)生正常軟骨組織[41-42]。軟骨細胞是錨定依賴性細胞，在培養(yǎng)板上生長需要黏附于材料表面，通常呈扁平狀鋪展。而在水凝膠支架中，軟骨細胞形態(tài)為圓形或卵圓形，與其在天然軟骨基質(zhì)中相近，因而有利于維持正常表型。有研究表明，生長狀態(tài)成圓形或卵圓形的間充質(zhì)干細胞也更傾向于向軟骨細胞分化。

標準的軟骨細胞培養(yǎng)方式為細胞團塊培養(yǎng)，在 3D 環(huán)境中團塊內(nèi)細胞間的直接接觸會促進軟骨細胞保持分化狀態(tài)[34]?，F(xiàn)在，水凝膠被廣泛用于構(gòu)建 3D 細胞培養(yǎng)，以此研究細胞外基質(zhì)、細胞－細胞接觸效應以及細胞增殖、遷移和分化等課題[43]。Sridharan 等[34]比較了兔骨髓間充質(zhì)干細胞在水凝膠 3D 結(jié)構(gòu)中團塊培養(yǎng)和單細胞懸液培養(yǎng)的結(jié)果，證實團塊培養(yǎng)可以加強細胞生物合成和生成軟骨的能力，且團塊內(nèi)細胞數(shù)量越多，合成能力越強。

四、GelMA 復合支架的研究

由于水凝膠與細胞外基質(zhì)高度的相似性，組織工程對其展開了大量的研究。人工合成材料水凝膠有著良好的力學特性，但其缺乏生物活性。而生物材料水凝膠的生物學特性雖可以滿足細胞要求，但缺少機械強度和力學可控性。因此，選用單一材料制備的生物支架效果并不理想，而復合支架逐漸成為研究熱點。GelMA 的生物相容性和降解性極佳，多項研究對 GelMA 復合材料進行了探究，并獲得較為滿意的結(jié)果。

五、GelMA 與其它生物材料結(jié)合

軟骨細胞在不同種類的水凝膠中表現(xiàn)各異[44]，Levett等[44]研究了常用于軟骨修復工程的四種水凝膠——明膠，透明質(zhì)酸，聚乙二醇和藻酸鹽。作者將四種水凝膠分別修飾甲基丙烯酸酐以使其具有光交聯(lián)能力，而后將軟骨細胞封裝其中進行 3D 培養(yǎng)。研究顯示，明膠水凝膠促進了細胞增殖和糖胺聚糖基質(zhì)的沉積，此基質(zhì)能顯著改變水凝膠的力學強度。但明膠中的部分細胞由于發(fā)生去分化現(xiàn)象而分泌 I 型膠原。軟骨細胞在透明質(zhì)酸水凝膠組再分化狀態(tài)最佳，但其新生成的基質(zhì)僅集中在細胞周圍區(qū)域。隨后，Levett 等[45]將明膠和透明質(zhì)酸結(jié)合構(gòu)成了 GelMA / HAMA ( 甲基丙烯酰胺基透明質(zhì)酸 ) 復合水凝膠，隨后作者將人軟骨細胞置于 GelMA / HAMA 中培養(yǎng)，并通過基因檢測和免疫熒光檢測證實該復合支架能加強細胞成軟骨能力。此外，作者還發(fā)現(xiàn)在 GelMA / HAMA 中，軟骨細胞維持了圓形的細胞表型并使 ECM 的分泌量增加。

Suo 等[46]通過負載丙烯酰胺基葡萄糖 ( AGA ) 的光交聯(lián)明膠水凝膠來調(diào)節(jié) GelMA 的性質(zhì)。隨后對 GelMA / AGA 進行流變學和微形態(tài)檢測，結(jié)果顯示該水凝膠膨脹率、明膠溶解度及水凝膠降解率降低。這些特性的改變使GelMA / AGA 更為穩(wěn)定。此外，AGA 毒性比單純氨基葡萄糖低，在細胞毒性實驗中，水凝膠溶解所釋放的 AGA 未引起細胞凋亡增加，因此適當增加 AGA 含量可促進軟骨細胞生長。

Visser 等[47]將馬軟骨、半月板和肌腱組織經(jīng)脫細胞處理后溶解，修飾甲基丙烯酸酐并與 GelMA 構(gòu)成復合水凝膠。而后分別加入馬軟骨細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)。結(jié)果顯示，三組新型水凝膠均無細胞毒性，但封裝軟骨細胞的三組水凝膠中 DNA、糖胺聚糖、II 型膠原含量均不如對照組 ( 單純 GelMA 組 )。而封裝骨髓間充質(zhì)干細胞的三組水凝膠結(jié)果和對照組相似，且糖胺聚糖 / DNA 比值較對照組高，但差異無統(tǒng)計學意義。該實驗盡管未能證明上述三種復合水凝膠有更好的軟骨修復能力，但間接證明了骨髓間充質(zhì)干細胞成軟骨能力比單純軟骨細胞更優(yōu)。另有文獻指出，軟骨細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)能更好地引導間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化[48]。

六、GelMA 與合成材料結(jié)合

Gao 等[49]制備的光交聯(lián)二 PEG ( 甲基丙烯酸聚乙二醇酯 ) / GelMA 比單純 GelMA 的壓縮模量高 10倍。運用噴墨式生物打印機將間充質(zhì)干細胞均勻分布在 PEG / GelMA支架上培養(yǎng) 21天后，其 SOX9表達量、II 型膠原和蛋白多糖含量均有顯著性增加。Boere 等[39]將聚甲基丙烯酰基－聚 ( 羥甲基己交酯－ε－己內(nèi)酯 )－聚 ( ε－己內(nèi)酯 ) ( pMHMGCL / PCL ) 與 GelMA 通過紫外線聚合共價交聯(lián)構(gòu)成復合水凝膠。將該水凝膠填充入關(guān)節(jié)軟骨缺損模型后光交聯(lián)固化，隨后對其施加模擬正常關(guān)節(jié)運動的軸向及轉(zhuǎn)動力量，檢測數(shù)據(jù)顯示的其抵抗力較單純 GelMA 組有顯著提高，且檢測到大量的 II 型膠原在支架和自身組織交界處沉積。體外軟骨細胞 3D 培養(yǎng) 6周后，通過免疫熒光檢測證實軟骨細胞可產(chǎn)生軟骨特異性基質(zhì)。

軟骨基質(zhì)鈣化區(qū)是軟骨的最深層結(jié)構(gòu)，其 II 型膠原含量只占 20%，而 65% 為羥磷灰石 ( HAP )，與軟骨下骨接近 ( 86% )[50]，故軟骨鈣化區(qū)具有較高的硬度，但生軟骨能力較低。Bartnikowski 等[51]將藻酸鹽 / HAP，GelMA以及 GelMA / HAMA 相互組合，構(gòu)成 GelMA－藻酸鹽 / HAP，GelMA / HAMA－藻酸鹽 / HAP 兩種新型復合水凝膠，以期在增加水凝膠機械強度的同時，不影響軟骨細胞的增殖與合成。隨后作者將軟骨細胞封裝其中，并用光交聯(lián)構(gòu)成 3D 培養(yǎng)體系。培養(yǎng)后第 1天細胞活性檢測為 80%存活率，故細胞毒性較低。在細胞培養(yǎng)期間，兩組復合水凝膠的彈性模量顯著大于對照組 ( GelMA－藻酸鹽組 )。而培養(yǎng) 28天的結(jié)果顯示兩組新型水凝膠并未對軟骨細胞存在消極影響。綜上所述，作者認為該復合水凝膠可以作為軟骨修復支架的基礎(chǔ)而進行進一步的研究。

總之，GelMA 在軟骨修復組織工程領(lǐng)域中將發(fā)揮重要作用。將天然明膠通過化學修飾甲基丙烯酸酐后，經(jīng)紫外光照交聯(lián)形成的 GelMA 不僅具有良好的生物組織相容性和降解率，同時也與天然的軟骨細胞外基質(zhì)高度相似，這有利于細胞代謝及生物合成。水凝膠中的廣泛存在細胞黏附位點可以使封裝在內(nèi)的細胞擴散遷移，也可促進外周細胞的長入。GelMA 擁有的以上特點是其作為生物材料的基礎(chǔ)。

由于水凝膠修飾了甲基丙烯酸酐而使其具有了可調(diào)控的力學特性，為封裝的細胞提供了保護和支撐，但其強度仍不能與天然軟骨相當。借助其它生物或合成材料的高強度特點與 GelMA 相結(jié)合所形成的復合支架，能有效解決GelMA 力學強度不足的缺陷。但高強度的材料往往具有較差的生物組織相容性和難以調(diào)控的降解率，故如何選擇材料及平衡兩者之間的比例還需要不斷的探索和嘗試。

目前，對于 GelMA 支架的研究很多，而如何將其轉(zhuǎn)化進入臨床則是研究者們面臨的共同問題。現(xiàn)在缺乏對該水凝膠制備過程中各種條件參數(shù)的共識，包括 GelMA 的合成標準，與其它材料的結(jié)合標準以及水凝膠 3D 細胞培養(yǎng)的流程。比如目前交聯(lián)的金標準是紫外光配合光引發(fā)劑Irgacure 2959，但對于紫外線波長、光照時間和 Irgacure 2959的濃度卻還無定論。且由于紫外線本身存在的缺陷，將來是否利用可見光代替也在進一步研究中。因此，上述亟待解決的問題可為今后的研究指明方向，為轉(zhuǎn)化臨床應用提供基礎(chǔ)。

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( 本文編輯：李貴存 )

A brief review of gelatin-methacryloyl hydrogels for the therapeutical application of articular cartilage defect repair

ZHANG Chuan-xin, LI Liang, WU Hai-shan.
Department of Joint Surgery, Changzheng Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai, 200003, China Corresponding author: WU Hai-shan, Email: drisland@vip.sina.com

Tissue engineering has made promising progresses in the aspect of cartilage repair in nearly two decades. The use of hydrogel-based scaffolds not only promotes the extracellular environment for 3D cell culture, but also provides suitable mechanical properties. Among all kinds of hydrogels, gelatin methacryloyl hydrogels ( GelMA ) have gained great interest due to their appropriate biological properties and tunable physicochemical characteristics. This photocrosslinkable hydrogels can crosslink to form networks with tunable mechanical properties when exposed to UV light. GelMA highly mimics extracellular matrix ( ECM ) so that they can facilitate cell-attaching and retain metalloproteinase responsive peptide motifs. These characteristics allow chondrocytes to proliferate and spread in hydrogels, and contribute to self-degradation. Hybrid hydrogels can be fabricated by mixing GelMA with other polymers combineing biocompatibility and mechanical strength. GelMA plays a critical pioneering role in the fi eld of articular cartilage repair and has promising prospects in clinical applications.

Tissue engineering; Cartilage, articular; Cell culture techniques; Hydrogels; Injuries, cartilage; Gelatin methacryloyl hydrogels

10.3969/j.issn.2095-252X.2017.08.015

R681.3, R318

200003 上海，第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院關(guān)節(jié)外科

吳海山，Email: drisland@vip.sina.com

2016-10-27)