分光光度法測(cè)定銅綠微囊藻細(xì)胞密度研究

周緒申，馬帥領(lǐng)，尚志鳴，王 迎，郭麗峰，林 超

(1.海河流域水環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，天津 300170;2.北京空間機(jī)電研究所，北京 100191; 3.海河流域水資源保護(hù)局，天津 300170)

分光光度法測(cè)定銅綠微囊藻細(xì)胞密度研究

周緒申1，馬帥領(lǐng)2，尚志鳴2，王 迎1，郭麗峰1，林 超3

(1.海河流域水環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，天津 300170;2.北京空間機(jī)電研究所，北京 100191; 3.海河流域水資源保護(hù)局，天津 300170)

本文通過(guò)測(cè)定純種銅綠微囊藻的分光光度吸收曲線(xiàn),分析其吸收峰值,并建立了不同藻細(xì)胞密度與吸收峰值的線(xiàn)性關(guān)系,從而提供一種快速、簡(jiǎn)單的銅綠微囊藻細(xì)胞密度分光光度測(cè)定方法。結(jié)果表明:銅綠微囊藻在440和680nm波長(zhǎng)處各有一個(gè)較大的吸收峰,銅綠微囊藻不同藻細(xì)胞密度與2波長(zhǎng)的光吸收值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系,細(xì)胞密度與葉綠素a含量也呈較好的線(xiàn)性關(guān)系。

銅綠微囊藻;分光光度法;吸光特性;細(xì)胞密度

1 簡(jiǎn)介

藍(lán)藻通常指藍(lán)藻門(mén)(C y a no phy t a)的植物，又叫藍(lán)綠藻，由于藍(lán)藻中不含葉綠素 b、c，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的單細(xì)胞藻類(lèi)對(duì)模型進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)分析驗(yàn)證，趙巧華［1］認(rèn)為同一藻的標(biāo)準(zhǔn)化吸收光譜在不同生長(zhǎng)時(shí)期基本恒定不變，色素組成及其比例的不同是引起藻類(lèi)間吸收光譜變化的主要原因。深入了解藻類(lèi)對(duì)光的吸收特性及對(duì)光的競(jìng)爭(zhēng)能力，有助于了解水生生態(tài)系統(tǒng)的演變、浮游植物的種群組成、演替及藍(lán)藻水華的形成機(jī)理。銅綠微囊藻(Mi c r o c y s i s ae r ugi no s a)屬于藍(lán)藻門(mén)球藻目微囊藻屬，是一種全球廣泛分布的淡水藍(lán)藻，極易在富營(yíng)養(yǎng)化淡水中形成水華，并且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，控制難度大、危害性大［2］，同時(shí)該藻不易被魚(yú)類(lèi)消化，嚴(yán)重破壞水生態(tài)環(huán)境。

水體富營(yíng)養(yǎng)化中藻類(lèi)監(jiān)測(cè)指標(biāo)主要包括生物量、藻密度和葉綠素a等［3］。其中葉綠素a是藻類(lèi)重要的組成成分之一，其濃度的高低是表征光能自養(yǎng)生物量的重要指標(biāo)。葉綠素a含量的高低與水體藻類(lèi)的種類(lèi)、數(shù)量等密切相關(guān)［4］。

有研究表明，通過(guò)測(cè)定水體中葉綠素a在一定程度上可以反映水體中藻類(lèi)數(shù)量的多少和水質(zhì)狀況。葉綠素a與藻密度的變化都符合微生物生長(zhǎng)的S型曲線(xiàn)，2者都可以表征水體生物量和水華預(yù)警的表征參數(shù)［5］。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的純種銅綠微囊藻，研究其光吸收光譜，以期得出適合于檢測(cè)銅綠微囊藻細(xì)胞密度的簡(jiǎn)單可靠的分光光度方法，為今后室內(nèi)藻類(lèi)實(shí)驗(yàn)研究提供可靠數(shù)據(jù)資料和簡(jiǎn)便的計(jì)量方式，也為野外監(jiān)測(cè)湖泊水體中的微囊藻水華的藻密度提供數(shù)據(jù)支持，并為更深入了解藻類(lèi)對(duì)光的吸收特性及對(duì)光的競(jìng)爭(zhēng)能力提供了重要理論依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

銅綠微囊藻(Mi c r o c y s t i s ae r ugi no s a)購(gòu)于中國(guó)淡水藻種庫(kù)，藻種擴(kuò)大培養(yǎng)采用B G-11培養(yǎng)基，銅綠微囊藻培養(yǎng)采用人工氣候箱(寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng))，培養(yǎng)條件設(shè)置為:光照度4000 l x，光暗周期12h∶12h，溫度28℃，pH值為7.0。

銅綠微囊藻吸光值用光柵分光光度計(jì)(722型，上海第三分析儀器廠(chǎng))測(cè)定，掃描波長(zhǎng)的范圍為300～900nm，掃描間隔為5nm。

細(xì)胞密度在光學(xué)顯微鏡(Z E I SS Sc o peA 1)下進(jìn)行測(cè)定，采用浮游生物計(jì)數(shù)框(0.1m l，購(gòu)于中科院水生生物研究所)計(jì)數(shù)，分別計(jì)1、3、5行共30個(gè)方格數(shù)值，通過(guò)所記數(shù)值與小格體積計(jì)算藻細(xì)胞密度。藻細(xì)胞對(duì)比采用藻類(lèi)分類(lèi)檢測(cè)儀(B B E，F(xiàn) l uo r o P r o be)進(jìn)行測(cè)定。

葉綠素a濃度采用經(jīng)過(guò)0.45 μ m的纖維濾膜抽濾100m L，反復(fù)凍融-浸提，運(yùn)用改進(jìn)的丙酮萃取方法進(jìn)行測(cè)定。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 銅綠微囊藻光吸收曲線(xiàn)

以擴(kuò)大培養(yǎng)的銅綠微囊藻在分光光度計(jì)上做300～900nm之間的范圍做掃描，以300nm為起始點(diǎn)每間隔5nm做一次掃描，作銅綠微囊藻的光吸收曲線(xiàn)，如圖1所示。

圖1 銅綠微囊藻光吸收曲線(xiàn)

由圖1可知，銅綠微囊藻在440和680nm處分別有一個(gè)較大的吸收峰，這是由銅綠微囊藻含有葉綠素a所致，在620nm左右較寬的吸收峰，是銅綠微囊藻含有藻藍(lán)蛋白的緣故［6］。

3.2 銅綠微囊藻稀釋倍數(shù)與吸光值的關(guān)系

雖然銅綠微囊藻 440和 680nm處的峰值較大，但數(shù)值是否與藻密度有線(xiàn)性關(guān)系未知。故將密度為109個(gè)/L的銅綠微囊藻稀釋成不同密度的藻液，做曲線(xiàn)比對(duì)440和680nm處的吸光值，如圖2所示。

由圖2可知，銅綠微囊藻在440和680nm的吸光值與稀釋倍數(shù)成較好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性關(guān)系和回歸系數(shù)分別為:y=0.8431x+0.034(440nm)，R2=0.9973;y=0.7886x+0.0293(680nm)，R2=0.9945。

3.3 銅綠微囊藻吸光度與藻密度的關(guān)系

由于稀釋倍數(shù)直接與細(xì)胞密度成反比的線(xiàn)性關(guān)系，而稀釋倍數(shù)與440和680nm的吸光值線(xiàn)性關(guān)系都較好，因此440和680nm的吸光值可作為銅綠微囊藻細(xì)胞密度的反映。為探討其計(jì)算的關(guān)系式，將不同密度銅綠微囊藻分別做440和680nm的吸光值曲線(xiàn)，如圖3所示。

圖2 銅綠微囊藻稀釋倍數(shù)的倒數(shù)與吸光值的曲線(xiàn)(上440n m，下680n m)

圖3 銅綠微囊藻吸光度與藻密度的關(guān)系(上440n m，下680n m)

銅綠微囊藻密度與440和680nm的吸光值線(xiàn)性關(guān)系均較好，其線(xiàn)性方程和回歸系數(shù)分別為:y= 773.93x-3.5049(440nm)，R2=1和y=893.94x-8.2264(680nm)，R2=0.9994。

3.4 銅綠微囊藻葉綠素a濃度與藻密度的關(guān)系

銅綠微囊藻的藻密度與其葉綠素 a濃度關(guān)系未知，雖以前諸多研究涉及，但多為研究水體中的藻類(lèi)(藻類(lèi)多樣)，或者研究結(jié)果非常不一致。為取得純種銅綠微囊藻的藻密度與葉綠素a之間的關(guān)系式，本次實(shí)驗(yàn)取不同密度的銅綠微囊藻分別測(cè)定其葉綠素a的值，做曲線(xiàn)如圖4所示。

X 832

A

1008-1305(2016)05-0050-02

10.3969/j.issn.1008-1305.2016.05.019

2016-02-04

國(guó)家國(guó)際科技合作專(zhuān)項(xiàng)資助(2013D F A 71340)，國(guó)家水體污染控制與治理科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2012Z X 07203-002)，水利部科技推廣項(xiàng)目(T G 1408))，水利部技術(shù)引進(jìn)項(xiàng)目(201412)

周緒申(1982年—)，男，工程師。