云南苦茶提取物對(duì)鎘致小鼠肝臟損傷的保護(hù)作用

龔 頻， 馬逢樂(lè)， 何蓉蓉， 趙天雷， 常相娜， 陳福欣

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.暨南大學(xué) 中藥及天然藥物研究所， 廣東 廣州 510632； 3.西安科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院， 陜西 西安 710054)

云南苦茶提取物對(duì)鎘致小鼠肝臟損傷的保護(hù)作用

龔 頻1， 馬逢樂(lè)1， 何蓉蓉2， 趙天雷1， 常相娜1， 陳福欣3*

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.暨南大學(xué) 中藥及天然藥物研究所， 廣東 廣州 510632； 3.西安科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院， 陜西 西安 710054)

研究旨在探究云南苦茶提取物1,3,7,9-四甲基尿酸對(duì)鎘致小鼠肝臟損傷的保護(hù)作用.實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射氯化鎘和灌胃不同濃度四甲基尿酸的方法構(gòu)建小鼠模型，通過(guò)測(cè)定其肝臟組織內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化(LPO)程度、蛋白羰基化(PCO)程度、超氧化物歧化酶(SOD)活性和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性，以及一氧化氮(NO)的含量，研究鎘對(duì)肝臟的氧化損傷程度以及四甲基尿酸的作用效果.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，損傷組小鼠在鎘的作用下，肝臟中丙二醛(MDA)、PCO和NO的含量增加(p<0.001)，而灌胃不同劑量四甲基尿酸的各保護(hù)組MDA、PCO和NO的含量劑量依賴型減少；染鎘也致使損傷組中SOD、CAT活性明顯下降(p<0.01)，四甲基尿酸則有效緩解SOD、CAT活性的下降，其中在四甲基尿酸濃度分別為20 mg/(kg·d)與30 mg/(kg·d)時(shí)都有明顯的保護(hù)作用.鎘對(duì)小鼠肝臟造成氧化損傷與鎘打破機(jī)體的氧化和抗氧化之間的平衡，引起氧化壓力的增加有關(guān)；四甲基尿酸可能通過(guò)提高抗氧化酶活性，增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)的抗氧化能力，以及抗炎作用協(xié)同保護(hù)肝臟.

云南苦茶； 1,3,7,9-四甲基尿酸； 鎘； 肝臟； 氧化損傷

0 引言

鎘(cadmium，Cd)是一種人體非必需且有毒的重金屬元素.機(jī)體吸收后主要在肝臟和腎臟蓄積，且具有代謝率低，生物半衰期長(zhǎng)等特點(diǎn).鎘對(duì)機(jī)體許多組織器官都具有毒性作用[1]，肝臟則是低劑量慢性鎘暴露最主要的受損器官之一，本課題組之前的研究也已經(jīng)證明了鎘對(duì)肝臟的損傷作用[2]；Habeebu 等給成年雄性小鼠注射氯化鎘 (30μmol/L)，小鼠肝臟細(xì)胞凋亡結(jié)果呈時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系[3].大量的研究表明鎘進(jìn)入機(jī)體后會(huì)產(chǎn)生活性氧自由基，進(jìn)而對(duì)機(jī)體造成氧化損傷[4].

云南苦茶具有多種潛在的醫(yī)療用途，其主要活性提取物1,3,7,9-四甲基尿酸是一種嘌呤生物堿，結(jié)構(gòu)式如圖1所示.其結(jié)構(gòu)上類似于咖啡因而作用強(qiáng)于咖啡因，已有研究證明1,3,7,9-四甲基尿酸具有抗炎和止痛的作用[4,5].有研究表明大鼠長(zhǎng)期口服苦茶堿單體對(duì)大鼠鎘染毒產(chǎn)生的氧化損傷的保護(hù)反應(yīng)，或?qū)榭嗖鑹A開(kāi)發(fā)為藥物提供基礎(chǔ)[6].因此本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)構(gòu)建鎘誘導(dǎo)的小鼠肝臟損傷模型，研究四甲基尿酸對(duì)鎘致肝臟的氧化損傷的保護(hù)作用，為四甲基尿酸開(kāi)發(fā)成為重金屬鎘中毒防治藥物提供一定的數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù).

圖1 1,3,7,9-四甲基尿酸化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

健康清潔級(jí)昆明小鼠購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;1，3，7，9-四甲基尿酸(theacrine)提取于云南苦茶;氯化鎘(CdCl2)購(gòu)自天津市福晨化學(xué)試劑廠;Coomassie Brilliant Blue G250購(gòu)于瑞士Adamas公司;4,6-Dihydroxy-2-mercaptopyrimidine(TBA)購(gòu)于Alfa Aesar;2,4-Dinitrophenylhydrazine(DNPH)購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社;焦性沒(méi)食子酸購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；過(guò)氧化氫30%購(gòu)自天津市天力化學(xué)試劑有限公司；磺胺購(gòu)自阿達(dá)瑪斯公司；N-1-萘乙二胺鹽酸鹽購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;其他試劑均為分析純.

1.2 動(dòng)物分組和模型構(gòu)建

昆明小鼠30只，雄性，體重20～30 g，動(dòng)物模型構(gòu)建具體如表1所示.所有小鼠被隨機(jī)分成5組，每組6只，每天早晨定時(shí)給藥1次，CdCl2的給藥量為2 mg/(kg·d)，四甲基尿酸的給藥量分別為10 mg/(kg·d)、20 mg/(kg·d)、30 mg/(kg·d)，持續(xù)給藥14天，末次注射后禁食24 h，稱重，頸椎脫臼法處死，解剖并切取肝臟樣品，于-80 ℃冰箱保存待用.

表1 鎘致小鼠肝臟氧化損傷模型的

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

稱取肝臟樣品用Ph=7.4的磷酸緩沖溶液制備成10%的組織勻漿，蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法，LPO采用TBA法測(cè)定MDA含量的方法來(lái)測(cè)定，PCO的測(cè)定采用DNPH法，SOD活性測(cè)定采用聯(lián)苯三酚自氧化法，CAT活性采用鉬酸銨顯色法測(cè)定，NO含量采用Griess反應(yīng)來(lái)測(cè)定.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用mean±SE表示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).用單向方差分析法(one-way analysis of variance，ANOVA)和相應(yīng)的Student′s t-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義).

2 結(jié)果與討論

2.1 鎘的毒性對(duì)氧化指標(biāo)的影響以及四甲基尿酸的保護(hù)作用

脂質(zhì)和蛋白質(zhì)是活性氧的主要攻擊目標(biāo).鎘的毒性與細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)密切相關(guān)[7]，脂質(zhì)過(guò)氧化可以形成以MDA為主的終極產(chǎn)物，MDA的在體液和組織中的含量可以反映體內(nèi)脂質(zhì)氧化損傷水平.脂質(zhì)過(guò)氧化之外，蛋白質(zhì)的過(guò)氧化也是機(jī)體氧化損傷的結(jié)果之一，蛋白質(zhì)發(fā)生氧化后，可在氨基酸鏈上形成羰基，因而蛋白質(zhì)羰基化合物的含量可以作為衡量蛋白質(zhì)氧化損傷程度的指標(biāo).

由圖2可以看出，小鼠注射氯化鎘14天后，損傷組體內(nèi)MDA含量明顯高于空白組(p<0.001)，在喂飼不同濃度的四甲基尿酸以后，能夠緩解體內(nèi)MDA含量的增高(p<0.05)，而且隨著四甲基尿酸濃度的升高，MDA的含量呈濃度依賴性的減少，當(dāng)濃度為30 mg/(kg·d)，保護(hù)作用顯著(p<0.05).這表明了鎘的毒性可以誘發(fā)肝臟的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，同時(shí)四甲基尿酸的保護(hù)作用與劑量呈依賴關(guān)系.

同樣，從圖3可以看出鎘損傷組蛋白羰基化含量高于空白組(p<0.001，說(shuō)明鎘對(duì)小鼠肝臟有明顯的氧化損傷作用，當(dāng)給予不同劑量(20，30 mg/(kg·d))的TC作用后，能夠劑量依賴的減少肝臟中PCO的程度(p<0.05,P<0.05), 其中當(dāng)TC的濃度為30 mg/(kg·d)時(shí)，與損傷組相比，PCO的含量降低了54%(p<0.05),結(jié)果證明，鎘可以使肝臟PCO程度增加，而四甲基尿酸起到保護(hù)作用，且與劑量呈依賴關(guān)系.

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了MDA和蛋白羰基化合物的含量，結(jié)果顯示，鎘的毒性作用能明顯引起損傷組小鼠肝臟MDA和PCO含量增加，表明鎘可能誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化損傷的發(fā)生;而四甲基尿酸劑量依賴抑制LPO和PCO含量的增加，對(duì)肝臟起到了一定保護(hù)作用.

與空白組相比，**P<0.01；與鎘損傷組相比,#P<0. 05圖2 鎘致小鼠肝臟氧化損傷模型中 各組別的脂質(zhì)過(guò)氧化程度

與空白組相比，***P<0.001；與鎘致?lián)p傷組相比,##P<0.01圖3 鎘致小鼠肝臟氧化損傷模型中 各組別的蛋白羰基化程度

2.2 鎘的毒性對(duì)抗氧化酶的影響以及四甲基尿酸的保護(hù)作用

SOD和CAT都是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，廣泛存在動(dòng)物的各個(gè)組織中.SOD是生物體內(nèi)清除活性氧的首要物質(zhì).CAT是過(guò)氧化物酶體的標(biāo)志酶, 在肝臟中以高濃度存在，細(xì)胞內(nèi)的CAT可催化過(guò)氧化氫的分解，使其生成H2O從而無(wú)毒化以此減輕過(guò)氧化氫對(duì)細(xì)胞的氧化損傷，因此，CAT是機(jī)體抗氧化防御體系中的一個(gè)重要組成部分.

由圖4可以看出，建模14天后，損傷組肝臟SOD活性明顯低于空白組(p<0.01)，而四甲基尿酸可以有效緩解SOD的這種下降趨勢(shì)，在濃度為30 mg/(kg·d)，保護(hù)效果最為明顯，這說(shuō)明四甲基尿酸在體內(nèi)可以很大程度的增強(qiáng)SOD的活性，減少了SOD的損耗，從而起到保護(hù)作用.

由圖5可以看出，鎘的毒性可以造成小鼠體內(nèi)CAT含量的急劇下降(p<0.01)，給與不同濃度四甲基尿酸保護(hù)后，緩解了小鼠體內(nèi)CAT含量的減少，在四甲基尿酸濃度為20 mg/(kg·d)時(shí)，效果最明顯(p<0.01).

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，染鎘組肝臟中SOD和CAT活性水平明顯降低，可能由于鎘與SOD分子中的金屬輔基Zn發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性替代作用[8]，消耗并抑制住了SOD的活性，鎘毒性作用進(jìn)而導(dǎo)致肝臟中酶系統(tǒng)正常生理功能的破壞，CAT的活性也受到影響；四甲基尿酸的給予能夠有效改變肝臟中SOD和CAT的活性水平，從而減少了酶活性的損耗.

與空白組相比，**P<0.01；與鎘損傷組相比,##P<0.01圖4 鎘致小鼠肝臟氧化損傷模型中 各組別的超氧化物歧化酶活性

與空白組相比，**P<0.01；與鎘致?lián)p傷組相比,##P<0.01圖5 鎘致小鼠肝臟氧化損傷模型中 各組別的過(guò)氧化氫酶活性

2.3 鎘對(duì)小鼠肝臟炎癥因子的影響及四甲基尿酸的保護(hù)作用

NO是一種活性氧成分，在肝細(xì)胞的應(yīng)激損傷中起著重要作用，可與其他自由基結(jié)合形成毒性更強(qiáng)的自由基復(fù)合物[9].如圖6所示，與空白組相比，鎘的毒性能夠誘發(fā)損傷組小鼠肝臟NO含量顯著升高(p<0.01)，當(dāng)給予不同劑量(20，30 mg/(kg·d))的四甲基尿酸作用后，能夠劑量依賴的減少肝臟中NO的程度(p<0.05，p<0.05)，在濃度為30 mg/(kg·d)，保護(hù)效果最為明顯.

本研究表明鎘毒性可以誘發(fā)小鼠肝臟NO含量的急速增加，造成對(duì)肝臟的損傷，而四甲基尿酸可以降低NO含量，說(shuō)明鎘的毒性與NO含量有關(guān).

與空白組相比，*P<0.05；與鎘損傷組相比,#P<0.05圖6 鎘致小鼠肝臟氧化損傷模型中 各組別的一氧化氮含量

3 結(jié)論

鎘是一種生物蓄積性強(qiáng)，毒性持久，具有多種危害的有毒重金屬，肝臟是鎘毒性作用的首要靶器官[10,11].鎘損傷過(guò)程中能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生氧自由基和脂類自由基[12,13],增加氧化壓力，同時(shí)改變機(jī)體內(nèi)多種酶的活性，破壞抗氧化系統(tǒng)，造成機(jī)體內(nèi)多器官的氧化損傷與炎癥反應(yīng).本試驗(yàn)結(jié)果表明，鎘的毒性能夠引起肝臟的過(guò)氧化損傷，破壞酶和非酶性抗氧化系統(tǒng)的抗氧化能力，而四甲基尿酸可以有效的緩解鎘誘導(dǎo)肝臟氧化損傷，可能與四甲基尿酸改變了部分體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的氧化環(huán)境與抗氧化能力相關(guān)[14]，如增強(qiáng)抗氧化酶SOD和CAT的活性，拮抗機(jī)體的氧化壓力，減少NO的生成等.最終通過(guò)抗氧化以及抗炎作用協(xié)同保護(hù)肝臟[15,16]，這進(jìn)一步闡明了鎘致肝臟氧化損傷的作用機(jī)制，也為云南苦茶及四甲基尿酸的開(kāi)發(fā)提供了一定的理論依據(jù).

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【責(zé)任編輯：蔣亞儒】

Protective effect of theacrine on cadmium-induced mice hepatic damage

GONG Pin1, MA Feng-le1, HE Rong-rong2, ZHAO Tian-lei1,CHANG Xiang-na1, CHEN Fu-xin3*

(1.School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China； 2.Institute of Traditional Chinese Medicine and Natural Products, Ji′nan University, Guangzhou 510632, China; 3.School of Chemistry and Chemical Engineering, Xi′an University of Science and Technology, Xi′an 710054, China)

The study aims to investigate the protective effect of theacrine,the active extractive from Yunnan Bitter Tea,on cadmium-induced liver injury.Animal model were established by treating mice with CdCl2and different concentrations of theacrine.According to the levels of LPO,PCO and activities of SOD,CAT as well as the content of NO,the degree of Cd-induced hepatic injuries and the protective effect of theacrine were assessed.The results indicates that LPO and PCO content increase significantly in damage group compared to control group,and theacrine can reduce this tendency which shows a dose-dependent manner. Meanwhile,the activities of SOD and CAT reduced obviously in the damage group,theacrine can ameliorate these changes effectively. In conclusion,20 mg/(kg·d) or 30 mg/(kg·d) theacrine show an obviously protective effect against the injuries caused by Cd,however,the low concentration 10 mg/(kg·d) had no effect.The intoxication of Cd on mice liver might result from the interruption of the balance between oxidation and anti-oxidation，and then increase the oxidative stress；theacrine shows synergistic protective effect on mice liver by increasing the activity of antioxidant enzymes,enhancing the capacity of antioxidant system and anti-inflammatory properties.

Yunnan Bitter Tea, theacrine； cadmium； liver； oxidative damage

2016-10-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21407104, 81402815)

龔 頻(1983-)，女，湖南邵陽(yáng)人，副教授，博士，研究方向：藥理生理通訊作者:陳福欣(1981-)，男，河北吳橋人，副教授，博士，研究方向：藥理生理，chenfuxin1981@163.com

1000-5811(2017)01-0134-05

R285.5

A