體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的研究進(jìn)展

杜佳蕾，張曦元，萬 娜，葛 斌，李 璐*

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117）

體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的研究進(jìn)展

杜佳蕾，張曦元，萬 娜，葛 斌，李 璐*

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一類多潛能細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)臈l件下，能夠通過誘導(dǎo)分化成為神經(jīng)干細(xì)胞，在治療神經(jīng)系統(tǒng)方面的疾病具有良好的臨床應(yīng)用前景。本文對(duì)BMSCs體外分離培養(yǎng)方法、誘導(dǎo)方法及治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；分離培養(yǎng)；誘導(dǎo)分化；臨床應(yīng)用；神經(jīng)干細(xì)胞

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）具有自我復(fù)制能力屬于多潛能細(xì)胞，主要存在于骨髓、脂肪、臍帶、粘膜、肌肉、肺、肝、骨骼、胎盤、胰腺等，它在適宜條件下經(jīng)過誘導(dǎo)可以向骨、脂肪、軟骨等多種組織細(xì)胞分化。而BMSCs屬于間充質(zhì)干細(xì)胞中的一種，因其自身具有取材對(duì)機(jī)體的損傷小，容易在體外進(jìn)行分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增，回植體內(nèi)后不會(huì)發(fā)生免疫排斥反應(yīng)等特點(diǎn)而備受關(guān)注。本文將從BMSCs的分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法以及BMSCs對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療這三個(gè)方面加以介紹。

1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的的分離與培養(yǎng)

將體外培養(yǎng)的BMSCs放置于倒置相差顯微鏡下觀察，可以看到大多數(shù)的細(xì)胞呈梭形、紡錘形，少數(shù)形態(tài)表現(xiàn)為多角形，細(xì)胞核比較大，相鄰的細(xì)胞之間有縫隙進(jìn)行連接。隨著對(duì)BMSCs研究的不斷深入，現(xiàn)在研究建立的用于分離提取BMSCs的方法有很多，比如貼壁細(xì)胞分離培養(yǎng)法、密度梯度離心法還有免疫磁珠法、流式細(xì)胞儀法等，但是其不同的培養(yǎng)方法所取得的效果不同。

2 誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法

雖然現(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)BMSCs可以通過誘導(dǎo)向神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行分化，但是誘導(dǎo)方法的不同，所導(dǎo)致的誘導(dǎo)分化率也是不一樣的。目前在實(shí)驗(yàn)研究中用的較多的的誘導(dǎo)分化方法主要有以下三種：一、生長因子誘導(dǎo)法；二、各類中藥及其提取物的誘導(dǎo)法；三、共培養(yǎng)誘導(dǎo)法。

2.1 生長因子誘導(dǎo)法

細(xì)胞增殖和分化功能會(huì)受到各種生長因子的影響。生長因子誘導(dǎo)法主要是利用了各種細(xì)胞因子對(duì)BMSCs增殖和分化的調(diào)控機(jī)制。Long等[3]研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子（EGF）、堿性或纖維性細(xì)胞生長因子（bFGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）等細(xì)胞生長因子，這些生長因子可以促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化。

2.2 中藥及其取物的誘導(dǎo)法

中藥及其提取物可以影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化、增殖及其移植效果。張景欣等[4]將杜仲（10 mg/mL）加入到含有第四代BMSCs的培養(yǎng)液中，28 d后通過免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)杜仲可以提高BMSCs增殖和向神經(jīng)元分化的能力。王冠等[5]研究發(fā)現(xiàn)與單純堿性成纖維生長因子誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，堿性成纖維生長因子和黃芪多糖共同誘導(dǎo)組的所表達(dá)的神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽性細(xì)胞的比例較高（P＜0.05），這說明黃芪多糖可以促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)干細(xì)胞分化。魯巍等研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)川芎嗪藥物質(zhì)量濃度為10 mg/L時(shí)，它對(duì)成骨細(xì)胞的增殖和分化功能的促進(jìn)作用最為明顯。

2.3 細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)法

細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)法是將BMSCs與神經(jīng)細(xì)胞共同培養(yǎng)、讓細(xì)胞之間能夠相互接觸，然后利用BMSCs所在的微環(huán)境而將其誘導(dǎo)分化。這種方法作用的機(jī)制可能是神經(jīng)細(xì)胞與BMSCs共同生長的過程中，神經(jīng)細(xì)胞會(huì)分泌一些可以促進(jìn)BMSCs誘導(dǎo)分化的因子，再加上細(xì)胞之間的相互接觸，最終誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)干細(xì)胞分化。Ni等[7]將BMSC與嗅鞘細(xì)胞（OEC）共培養(yǎng)，免疫熒光檢測及RT-PCR等分析顯示，神經(jīng)細(xì)胞免疫反應(yīng)標(biāo)記物數(shù)量明顯增多，這些可以證明BMSCs與嗅鞘細(xì)胞（OEC）共同培養(yǎng)可以誘導(dǎo)分化成為神經(jīng)細(xì)胞。

3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療

一直以來，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病就是人類所面臨的重大疾病之一，在治療過程中，由于中樞神經(jīng)具有不可再生性的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響了此類疾病的治療效果和患者預(yù)后效果。BMSCs分布于體內(nèi)多種組織和器官中并具有多向分化的潛能，經(jīng)誘導(dǎo)可以向神經(jīng)干細(xì)胞分化。Abouelfetouh等在體外將BMSCs與海馬組織共同培養(yǎng)，觀察到BMSCs有向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化的情況，最終通過誘導(dǎo)分化成為了神經(jīng)細(xì)胞。同時(shí)，將BMSCs應(yīng)用于臨床治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，還避免了研究胚胎干細(xì)胞所存在的倫理性問題。由此認(rèn)為BMSCs向神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療方面具有更大的優(yōu)勢，將來可能成為神經(jīng)組織工程新的種子細(xì)胞來源，為臨床上治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了新的研究方向。

3.1 BMSCs對(duì)小兒腦性癱瘓的治療

小兒腦性癱瘓又稱腦癱，是小兒時(shí)期中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的一種疾病，但是具有很高的致殘率?；純撼诉\(yùn)動(dòng)發(fā)育比正常的同齡兒遲緩?fù)猓€常表現(xiàn)先天性肌遲緩、智力低下、肌肉萎縮等癥狀。所以尋找一種治療腦癱的安全有效方法就顯得尤為重要。

王亞莉研究發(fā)現(xiàn)采用患兒自體的BMSCs轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行移植治療的腦癱患兒在細(xì)胞移植后的在1個(gè)月后其運(yùn)動(dòng)能力就有個(gè)明顯的改善。BMSCs移植與康復(fù)鍛煉兩種方法具有疊加作用，共同使用對(duì)治療小兒腦癱療效更好。

3.2 BMSCs對(duì)腦卒中的治療

腦卒中（cerebral stroke）又被稱腦血管意外，被認(rèn)為是世界范圍內(nèi)造成人類死亡的第二大原因，而且治療后的效果并不理想，很大一部分的患者都會(huì)因病致殘。近年來，國內(nèi)外學(xué)者提出了通過自體BMSCs移植治療腦卒中的方法，并在研究中取得了一些成果。

王利平等研究發(fā)現(xiàn)BMSCs在體外培養(yǎng)經(jīng)誘導(dǎo)分化后通過流式細(xì)胞儀檢測可表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志，并且通過自體移植BMSCs治療腦卒中可以明顯的改善患者一些神經(jīng)功能缺失的癥狀。有臨床研究顯示，BMSCs動(dòng)脈內(nèi)移植方式是一種安全可行的促進(jìn)卒中患者神經(jīng)功能恢復(fù)的方式，其機(jī)制可能是可以使細(xì)胞到達(dá)距離損傷更近的動(dòng)脈末端。IshizakaS等研究也發(fā)現(xiàn)BMSCs 移植具有修復(fù)因缺血而遭受損傷的神經(jīng)系統(tǒng)再次進(jìn)行神經(jīng)之間聯(lián)接的潛能，通過移植治療有助于提高患者的運(yùn)動(dòng)功能。

3.3 BMSCs對(duì)脊髓損傷的治療

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病，受傷原因主要是因?yàn)榻煌ㄊ鹿屎透呖諌嬄洹Ｄ壳芭R床上對(duì)脊髓損傷患者脊神經(jīng)的萎縮與壞死缺乏有效的修復(fù)方法。而且其傷殘重、治療難、預(yù)后差，是國內(nèi)外神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。

高平等研究發(fā)現(xiàn)證實(shí)了采用經(jīng)過生物誘導(dǎo)后的BMSCs移植治療大鼠脊髓損傷比化學(xué)誘導(dǎo)后的BMSCs移植治療大鼠脊髓損傷的神經(jīng)恢復(fù)程度要高。趙錫武等也發(fā)現(xiàn)通過靜脈注射神經(jīng)干細(xì)胞和BMSCs都可以改善脊髓損傷大鼠的運(yùn)動(dòng)功能，建議將這兩種方法結(jié)合起來共同治療脊髓損傷，可以取得更好的治療效果。

綜上所訴，當(dāng)前研究BMSCs分離培養(yǎng)方法有很多種，在適當(dāng)條件下在誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)干細(xì)胞分化并成功表達(dá)出神經(jīng)元特異性標(biāo)志物的方法也有很多種，有著廣泛的應(yīng)用前景，并且在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面的應(yīng)用上已經(jīng)取得了良好的治療效果。雖然BMSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞的研究工作目前取得了很多的突破性的進(jìn)步，但是仍然存在一些沒有解決的問題。比如如何調(diào)控和提高BMSCs的分化率、干細(xì)胞定向分化的誘導(dǎo)因子以及它們作用的機(jī)制等等，因此，為了干細(xì)胞技術(shù)在臨床上的更廣泛的應(yīng)用，這些問題都需要我們一一解決。

[1]李曉峰,趙勁民,蘇 偉,崔向榮,羅世興,馬愛國.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定[J]. 中國組織工程研究與臨床康復(fù),2011,(10):1721-1725.

[2]張景欣,王 智,馬 明.杜仲對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和向神經(jīng)元分化的影響[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2016,05(8):945-948.

R617

A

ISSN.2095-6681.2017.27.32.02

杜佳蕾（1993-），女，山東省菏澤市人，長春中醫(yī)藥大學(xué)，在讀研究生，公共衛(wèi)生專業(yè)，營養(yǎng)與食品衛(wèi)生方向

李 璐

本文編輯：劉帥帥