GeneXpert MTB/RIF技術(shù)回顧

張 麗,郗志華,霍俊杰,張皎月

(太原市第四人民醫(yī)院,山西 太原 030053)

GeneXpert MTB/RIF技術(shù)回顧

張 麗,郗志華,霍俊杰,張皎月

(太原市第四人民醫(yī)院,山西 太原 030053)

目的：探討GeneXpert MTB/RIF技術(shù)在肺結(jié)核診斷及利福平耐藥檢測中的價(jià)值。方法：回顧性分析27例痰結(jié)核菌培養(yǎng)陽性和4例非結(jié)核病患者，比較涂片抗酸染色法、結(jié)核分枝桿菌實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(TB-PCR)、GeneXpert MTB/RIF技術(shù)的陽性率，并對(duì)培養(yǎng)陽性菌株做比例法藥敏與GeneXpert MTB/RIF利福平耐藥性對(duì)比。結(jié)果：GeneXpert MTB/RIF技術(shù)陽性率96.3%，明顯高于涂片抗酸染色法63.0%及TB-PCR66.7%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，GeneXpert MTB/RIF利福平耐藥性與比例法藥敏一致。結(jié)論：GeneXpert MTB/RIF技術(shù)在肺結(jié)核診斷中有重要價(jià)值。

GeneXpert；MTB/RIF；TB-PCR；肺結(jié)核

我國是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家, 發(fā)病率僅次于印度，也是世界衛(wèi)生組織認(rèn)定的27個(gè)耐多藥及廣泛耐藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一[1]。隨著耐多藥患者的日益增多，我國結(jié)核疫情更加嚴(yán)峻。 世界衛(wèi)生組織強(qiáng)調(diào)控制結(jié)核病的主要方法是普及快速、高效的檢測診斷技術(shù)，因此快速的檢測和耐藥性測試是首當(dāng)其沖[2]。目前實(shí)驗(yàn)室的快速診斷方法有涂片抗酸染色法、結(jié)核分枝桿菌實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(TB-PCR)，可都不能滿足臨床需要。 GeneXpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)(Genexpert)由美國Cephid公司研發(fā)，能同時(shí)檢測結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥檢測于一身的新技術(shù)。為結(jié)核病診斷及利福平耐藥情況提供了科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年8月～2015年9月就診于太原市第四人民醫(yī)院的疑似結(jié)核病患者31例，通過痰結(jié)核菌培養(yǎng)確診27例，男16例，女11例，年齡14～80歲，平均(46.2±3.4)歲；4例非結(jié)核患者，男3例，女1例，平均年齡48歲。兩組患者的年齡、性別等一般情況無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

1.2 試劑與儀器

二級(jí)生物安全柜(海爾)，抗酸染液、羅氏培養(yǎng)基(珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑及儀器(中山達(dá)安股份有限公司)，全球基金項(xiàng)目配備的GeneXpert 檢測儀及試劑。

1.3 方法

1.3.1 涂片抗酸染色 竹簽挑取干酪樣痰，在玻片2/3處涂，面積為(1×2) cm2，行抗酸染色，鏡檢。參照《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》[3]。

1.3.2 羅氏培養(yǎng)及羅氏比例法藥敏 吸取1～2 mL痰，加入2倍4%氫氧化鈉處理15 min，在酸性培養(yǎng)基上加入1.5 mL消化后的液體分離培養(yǎng)，按《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》[4]要求。當(dāng)酸性培養(yǎng)基長足夠菌落時(shí)，刮取足量配置濃度做比例法利福平藥敏，按《結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》[4]操作。

1.3.3 TB-PCR 采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供的結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑(PCR-熒光法)，對(duì)痰中結(jié)核分枝桿菌DNA進(jìn)行分析，嚴(yán)格按操作說明。

1.3.4 GeneXpert 技術(shù) a) 用美國Cephid公司提供的消化液消化1 mL痰液15 min，消化液量視情況而定。b) 吸取2 mL消化后的液體加入試劑盒。c) 把試劑盒放入檢測儀中，編號(hào)登記。d) 經(jīng)1.5 h，由電腦軟件自動(dòng)讀取結(jié)果，可以同時(shí)檢測出結(jié)核分支桿菌的量及利福平耐藥性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)以羅氏培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，涂片抗酸染色陽性17例，陽性率63.0%；TB-PCR陽性18例，陽性率66.7%；GeneXpert陽性26例，陽性率96.3%；GeneXpert較涂片抗酸染色法陽性率高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.20，P<0.05)，見表1；GeneXpert較TB-PCR法陽性率高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.90，P<0.05)，見表2。TB-PCR法較涂片抗酸染色法陽性率高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.08，P﹥0.05)，見表3。

在涂陰培陽患者中GeneXpert陽性率90%，TB-PCR陽性率80%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.40，P﹥0.05)，見表4；在涂陽培陽患者中GeneXpert陽性率100%，TB-PCR陽性率58.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.80，P<0.05)，見表5。比例法藥敏與GeneXpert利福平耐藥檢測一致，3例耐藥，24例敏感。

表1 GeneXpert與涂片抗酸染色法檢測結(jié)果比較 例

表2 GeneXpert與TB-PCR法檢測結(jié)果比較 例

表3 TB-PCR法與涂片抗酸染色法檢測結(jié)果比較 例

表4 GeneXpert與TB-PCR法檢測結(jié)果比較 例

表5 GeneXpert與TB-PCR法檢測結(jié)果比較 例

3 討論

本研究主要討論涂片抗酸染色、TB-PCR、GeneXpert 3種方法對(duì)肺結(jié)核的診斷價(jià)值，以期對(duì)臨床提供快速、簡單、高效的幫助，早發(fā)現(xiàn)早治療有助于控制結(jié)核疫情。涂片抗酸染色檢測操作簡單，成本低，但不能分清結(jié)核分枝桿菌或非結(jié)核分枝桿菌，存在假陽性。熒光定量TB-PCR是體外擴(kuò)增檢測結(jié)核分枝桿菌基因，但是報(bào)道的陽性率差異很大。TB-PCR法存在假陽性與假陰性等問題[5]，目前不能作為肺結(jié)核診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。出現(xiàn)假陰性的原因可能是痰中菌量少，標(biāo)本中含有TaqDNA抑制物[6]；出現(xiàn)假陽性的原因可能是操作過程有污染。

GeneXpertMTB/FIR技術(shù)是半巢式實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)體外診斷方法，簡化了傳統(tǒng) PCR檢測步驟(樣品的制備，核酸的提取、擴(kuò)增，目標(biāo)序列的檢測等)，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。 其步驟在獨(dú)立的一次性試劑盒內(nèi)由系統(tǒng)自動(dòng)完成， 相比傳統(tǒng)的PCR 方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)：a) 準(zhǔn)確、敏感-獨(dú)特的PCR反應(yīng)設(shè)計(jì)全自動(dòng)操作及內(nèi)參設(shè)計(jì)確保結(jié)果準(zhǔn)確、敏感、可靠；b) 快速簡便-檢測只需1.5 h，PCR步驟自動(dòng)化；c) 實(shí)驗(yàn)室生物安全要求低，生物安全性高-獨(dú)立包裝完成。 GeneXpert檢測試劑盒能檢測樣本中的結(jié)核分支桿菌和與利福平耐藥相關(guān)的rpoB基因, 能對(duì)耐多藥患者進(jìn)行初篩，有很高的敏感性和特異性，檢驗(yàn)周期短。本研究 GeneXpert陽性率96.3%與王怡心等[7]報(bào)道93.7%相近，特異性100%高于王怡心等[7]報(bào)道87.5%，可能與例數(shù)少有關(guān)。在涂陽患者中GeneXpert陽性率100%與張志國等[8]報(bào)道的GeneXpert檢測涂陽患者陽性率98.1%相近；涂陰患者中GeneXpert陽性率90%，是涂片抗酸染色的有效補(bǔ)充。GeneXpert利福平耐藥檢測與比例法藥敏一致，能急時(shí)提醒臨床用藥，大部分利福平耐藥同時(shí)耐異煙肼，有助于多耐藥患者的篩查。但該技術(shù)試劑成本比較貴。

綜上所述，GeneXpert技術(shù)操作簡單，快速，高效，生物安全高，可以推廣使用。

[1] 中華人民共和國衛(wèi)生部.衛(wèi)生部介紹全國肺結(jié)核疫情現(xiàn)狀[EB/OL].( 2011-03-21 )[2011-05-13].http://www.m oh.gov.Cn.

[2] Raviglione MC.The Global Plan to Stop TB,2006-2015[J].Int J Tuberc Lung Dis,2006,10(3):238-23.

[3] 中國疾病預(yù)防控制中心.痰涂片鏡檢質(zhì)量保證手冊(cè)[M].北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,2004.

[4] 趙雁林,王黎霞,成時(shí)明,等.分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化程序及質(zhì)量保證手冊(cè)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2013.

[5] 唐神結(jié),高 文.臨床結(jié)核病學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2011.

[6] 余小軍.聯(lián)合檢測血結(jié)核抗體和胸水TB-DNA對(duì)結(jié)核性胸膜炎對(duì)的診斷價(jià)值[J].實(shí)用臨床醫(yī)學(xué),2011,12(2):16-17.

[7] 王怡心,陳雄豪,林惠玲,等.XpertMTB/RIF技術(shù)在基層實(shí)驗(yàn)室結(jié)核病診斷中的應(yīng)用研究[J].分子診斷與治療雜志,2015,7(3):176-179.

[8] 張志國,歐喜超,孫 倩，等.利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性的研究[J].中國防癆,2013,35(1):13-16.

本文編輯：周文超

張 麗，女，檢驗(yàn)師，從事臨床檢驗(yàn)工作

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1671-0126(2016)05-0047-03