連翹葉提取物對(duì)小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)研究

侯蘇方 ，史向華 ，柴秋彥

(1. 山西省中醫(yī)學(xué)校，山西 太原 030012； 2.山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院，山西 太原 030006 )

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

連翹葉提取物對(duì)小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)研究

侯蘇方1，史向華2，柴秋彥2

(1. 山西省中醫(yī)學(xué)校，山西 太原 030012； 2.山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院，山西 太原 030006 )

目的：研究連翹葉提取物對(duì)小鼠的急性毒性，為臨床安全使用提供參考。方法：觀察受試樣品1次經(jīng)口給予動(dòng)物引起的不良反應(yīng)和死亡情況，確定半數(shù)致死劑量或最大耐受量。小鼠1次經(jīng)口灌胃給予連翹葉提取物后，連續(xù)觀察2周，記錄出現(xiàn)的反應(yīng)及死亡率；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱量體重，解剖動(dòng)物，稱量臟器濕重，計(jì)算臟器系數(shù)并測(cè)定部分血液生化指標(biāo)。結(jié)果：連翹葉提取物1次經(jīng)口灌胃給予動(dòng)物不能求得半數(shù)致死量和最大耐受量,最大給藥量為61.60 g/kg; 實(shí)驗(yàn)2周后，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、谷草氨基轉(zhuǎn)移酶、肌酐、尿素氮含量均無明顯改變；體重、臟器濕重及臟器系數(shù)與對(duì)照組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) 。結(jié)論：連翹葉提取物對(duì)小鼠的急性毒性很小，臨床應(yīng)用安全性較高。

小鼠；急性毒性；連翹葉；提取物

連翹為臨床常用清熱解毒藥，味苦且性微寒，歸肺、心和膽經(jīng)，具有清熱解毒、消腫散結(jié)及疏解風(fēng)熱的功效，在中醫(yī)臨床具有廣泛應(yīng)用；現(xiàn)代藥理研究也表明其有多方面的藥理作用[1]。連翹在華北地區(qū)分布廣泛，野生資源豐富，但由于使用量越來越大，開發(fā)不平衡，產(chǎn)地連翹資源仍然十分緊缺。近年來研究表明，連翹葉中所含連翹苷和連翹酯苷等有效成分與連翹相似，且抗菌效果優(yōu)于果實(shí)，為一巨大的潛在替代資源，已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)[2]。有關(guān)連翹葉提取物的毒性研究已有少量報(bào)道，但結(jié)果仍有差異，為了解本省連翹葉使用的安全性，本文觀察研究了連翹葉提取物對(duì)小鼠的急性毒性(單次給藥)實(shí)驗(yàn)，報(bào)告如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 樣品

連翹葉采自山西晉東南地區(qū)陵川縣境內(nèi)，時(shí)間為2016年5月下旬～6月上旬。陰干后粉碎成粗粉，過20目篩備用。

1.2 試劑

肌酐(CER)、尿素氮(BUN)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒購自北京中生北控生物科技股份有限公司;生理鹽水：石家莊四藥股份有限公司廠生產(chǎn)，批號(hào)：051110322；其他試劑均為市售分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

小鼠，雌雄各半，體重22～26 g,購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(京)2010-0003；飼養(yǎng)于山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院清潔級(jí)動(dòng)物室，許可證號(hào)：SYXK(晉)2010-0005；實(shí)驗(yàn)室溫度20±1℃、相對(duì)濕度40%～70%，全價(jià)營養(yǎng)顆粒飼料及消毒墊料均由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)3d后使用。

1.4 主要儀器及器皿

電子天平；100mL三角燒瓶；50mL燒杯；高壓滅菌器；藍(lán)芯玻璃注射器(1mL)；全自動(dòng)生化分析儀(SELECTRA-E，荷蘭威圖)

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品處理

連翹葉水提取物的制備。稱取干燥連翹葉(由課題組采于陵川)100 g，加800 mL去離子水，浸泡2 h后，煎煮提取30 min，濾出煎液，藥渣中再加500 mL去離子水20 min，過濾，合并2次濾液，溶液濃縮至體積為65 mL(濃縮體積根據(jù)溶液的黏稠度及抽藥灌胃是否順利情況而定)，濃度為1.54 g/mL(生藥/mL)，置4 ℃冰箱中儲(chǔ)藏備用。

2.2 測(cè)定方法

2.2.1 預(yù)試驗(yàn) 取小鼠24只，雌雄各半，隨機(jī)分4組，每組6只；實(shí)驗(yàn)前16 h禁食不禁水；以連翹葉水提取物最高濃度1.54 g/mL體重為高劑量，0.77 g/mL體重為中劑量，0.38 g/mL體重為小劑量，均按0.4 mL/10 g灌胃給藥1次；灌胃后常規(guī)飼養(yǎng)，觀察14 d，記錄小鼠死亡數(shù)，找出使小鼠0%和100%致死的藥物濃度，進(jìn)而以改良寇氏法求得半數(shù)致死量；如高劑量組部分小鼠死亡，則進(jìn)行最大耐受量(MTD)測(cè)定。若無小鼠死亡，則采用最大給藥量(MLD)測(cè)定。

2.2.2 半數(shù)致死量測(cè)定 取體重(20±2.0 g)小鼠，禁食不禁水過夜(16 h)后隨機(jī)分組， 每組10只，共6組。分別1次經(jīng)口灌胃給予上述制備的樣品溶液，依據(jù)中華人民共和國標(biāo)準(zhǔn)急性毒性試驗(yàn)要求，每組給藥量均為0.2 mL/10 g，從最大濃度1.54 g/mL開始，濃度依次按1：0.70～0.90等比遞減。分別在給樣品后0、1、2、4、12、24、48 h各觀察1次，記錄反應(yīng)情況及死亡情況。然后每日觀察1次，連續(xù)觀察14 d。記錄反應(yīng)情況及死亡率,計(jì)算LD50。

2.2.3 最大給藥量(MLD)測(cè)定 取體重20±2.0 g小鼠，禁食不禁水過夜(16 h)后隨機(jī)分組，分別為對(duì)照組、樣品組，每組10只，雌、雄各半。用藥組1 d內(nèi)連續(xù)2次(間隔4h)灌胃，每次劑量為0.2 mL/10 g；對(duì)照組給予等容量生理鹽水。然后連續(xù)觀察14 d，記錄反應(yīng)情況及死亡率,計(jì)算MLD。

2.2.4 體重、大體解剖、生化指標(biāo)及臟器系數(shù)的測(cè)定分別在給藥后第0、7、14 d時(shí)稱重，第14天將小鼠斷頭處死后采集血樣測(cè)定血液生理生化指標(biāo)，剖檢觀察各組小鼠主要臟器(心、肝、睥、腎)是否有異常變化，比較各組小鼠體重及臟器系數(shù)(心臟、肝臟、腎臟、脾臟與體重的比值)。

2.2.5 動(dòng)物反應(yīng)的觀測(cè)內(nèi)容 給藥后連續(xù)觀察14 d,給藥當(dāng)天結(jié)束后4h內(nèi)嚴(yán)密觀察動(dòng)物的毒性反應(yīng)。以后觀察時(shí)間內(nèi)每天早、晚各觀察1次。并記錄動(dòng)物反應(yīng)情況。觀查內(nèi)容：a)神經(jīng)系統(tǒng)：行為及反應(yīng)、異常運(yùn)動(dòng)、對(duì)刺激的反應(yīng)、神經(jīng)反射。b)呼吸系統(tǒng)：呼吸及其頻率、分泌物。c)胃腸系統(tǒng)：糞便性狀、腹部形態(tài)。d)泌尿生殖系統(tǒng)：會(huì)陰部(污穢)、外生殖器(腫脹)。e)眼：眼瞼(下垂)、眼球(突出、震顫等)。f)解剖檢查：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)解剖動(dòng)物，肉眼觀察心臟、肝臟、腎、脾、肺及胃腸等臟器的體積、顏色、質(zhì)地等變化。如發(fā)現(xiàn)動(dòng)物死亡立即進(jìn)行尸檢，觀察組織器官出現(xiàn)是否改變，記錄并在出現(xiàn)肉眼可見變化時(shí)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 LD50及最大耐受量

一次性灌胃 1.54 g/mL、0.4 mL/10 g后，高劑量組動(dòng)物出現(xiàn)倦伏、活動(dòng)減少，20 min后基本恢復(fù)正常，其余均未觀察到與用藥有關(guān)的不良反應(yīng)。連續(xù)觀察14 d，動(dòng)物均無死亡。低劑量組動(dòng)物未出現(xiàn)倦伏、活動(dòng)減少等癥狀，外觀無異常，亦無死亡，在本實(shí)驗(yàn)所用濃度及條件下不能求得LD50及最大耐受量，故進(jìn)行最大給藥量測(cè)定

3.2 最大給藥量

1 d內(nèi)連續(xù)兩次(間隔4 h)灌胃，給藥總劑量為0.4 mL/10 g后，動(dòng)物均出現(xiàn)倦伏、活動(dòng)減少，20～30 min后基本恢復(fù)正常，其余未觀察到與用藥有關(guān)的不良反應(yīng)。與對(duì)照組比較無明顯差異。連續(xù)觀察14 d，動(dòng)物均無死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后解剖動(dòng)物，亦未發(fā)現(xiàn)有肉眼可見的病理變化。故最大給藥量為61.60 g/kg(相當(dāng)于生藥量)。

3.3 體重變化結(jié)果

分別通過測(cè)量和記錄對(duì)照組和樣品組的體重變化，結(jié)果說明連翹葉提取物不會(huì)影響小鼠的生長(zhǎng)。見表1。各組小鼠體重?zé)o明顯變化(P>0.05)。

Table 1 Changes of Body Weight%

3.4 臟器病理剖檢與臟器系數(shù)變化

14 d后處死動(dòng)物，解剖后肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、胃腸等重要臟器變化；結(jié)果顯示樣品組與對(duì)照組小鼠各臟器色澤正常，未見出血、壞死、腫大等病變。測(cè)定臟器系數(shù)的結(jié)果見表2，兩組對(duì)比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

Table 2 Changes of Organ Coefficientg/100g

3.5 血液生化指標(biāo)的變化

采集到的血樣測(cè)定以下生化指標(biāo)：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、肌酐(CER)、尿素氮(BUN)，來說明連翹提取物對(duì)小鼠肝腎功能的影響。結(jié)果見表3，血液谷丙氨酸氨基移換酶(ALT)、天門冬氨酸氨基移換酶(AST)等值均在正常范圍且與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0．05)。

ALT(IU/mL)AST(IU/mL)BUN(mmol/L)CRE(μmol/L)對(duì)照組雌性26．55±8．07116．95±10．056．04±1．0727．36±3．88雄性24．68±8．22125．89±12．095．48±0．7428．34±3．48樣品組雌性24．88±9．30128．21±13．655．42±1．6926．5±3．02雄性25．36±6．08120．36±15．226．32±0．8527．3±1．04

4 討論

連翹葉提取物因受試物濃度或體積限制，一次灌胃在本實(shí)驗(yàn)所用濃度下不能求得LD50、最大耐受量(MTD)，所以作了最大給藥量試驗(yàn)。連翹葉提取物在最大藥物濃度、最大體積下灌胃給藥，未出現(xiàn)小鼠死亡，其最大給藥量(MLD)為61.60 g/kg。此劑量一次給藥對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重增長(zhǎng)、臟器系數(shù)(臟器 體重比)以及反映肝腎功能的主要生化指標(biāo)均未見有明顯的影響。屬于實(shí)際無毒性物質(zhì)，表明該連翹葉急性毒性極低，臨床應(yīng)用較為安全，有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同以往文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果近似[3]，也有不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道[4]，究其原因，可能是因連翹葉提取物制備方法的不同造成的差異。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，連翹葉具有多方面的藥理作用[5]。連翹葉所含化學(xué)成分的研究表明，連翹葉里含有連翹苷、連翹酯苷、蘆丁、右旋松脂酚等化學(xué)成分，與連翹果實(shí)十分類似，而且連翹葉里相關(guān)成分的含量遠(yuǎn)高于連翹果實(shí)，其中連翹苷含量差別約10倍以上[6]，連翹酯苷差別約5～10倍[7]。

由于連翹苷、連翹酯苷、蘆丁、三萜類等成分被認(rèn)為是中藥連翹中的活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎、抑制彈性蛋白酶等多種活性，所以連翹葉也可能具有連翹藥材同樣的藥理活性，且毒性較低，使用安全。同時(shí)由于連翹葉資源豐富，產(chǎn)量受氣候條件影響較小等原因，所以具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。

[1] 張海燕.連翹化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].中藥材,2000,23(10): 657-660.

[2] 曲歡歡，翟西峰，孫文基，等．連翹不同部位中連翹酯苷和連翹苷的含量分析[J].藥物分析雜志，2008,28(3):382-385.

[3] 艾 霞，董雪婷，王麗潔，等.連翹葉水提取物對(duì)小鼠急性毒性和微核試驗(yàn)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(11):6397-6398.

[4] 李 曉，郭 唯，陳 飛，等．連翹葉不同提取物急性毒性實(shí)驗(yàn)研究[J].飼料研究，2013(1):11-12.

[5] 薛愧玲,袁王俊.連翹葉的藥理研究綜述[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2009,20(5):1149-1150.

[6] 丁 岡，劉延澤.中藥連翹及其同屬植物研究近況[J].中藥材，1994,17(10):42-44.

[7] 靖 會(huì)，李教社，曹 蔚，等.高效液相色譜法測(cè)定連翹中連翹酯苷的含量[J]. 西北藥學(xué)雜志，2003,18(4)：156-157.

本文編輯：王知平

Study on Acute Toxicity of Extract of Forsythia Suspensa Leavies in Mice

HOU Sufang1，SHI Xianghua2，CHAI Qiuyan2

(1.ChineseMedicineSchoolinShanxiProvince，Taiyuan030012，Shanxi，China；2.ShanxiAcademyofMedicalandLifeSciences，Taiyuan030006，Shanxi，China)

Objective:To study the acute toxicity of the extract of forsythia suspensa leavies in mice, and to make sure the safety of clinical application. Methods:The animal reactions and death rate were observed according to the indexes in the acute toxicity test. The half lethal dose (LD50) and the maximum tolerance dose (MTD) were recorded in the pre-experiment to determine the initial dose.The mice were grouped randomly in the formal experiment,Which were recorded for 14 days. The ALT、AST、CER、BNU and body weight were measured. Results:Based on the acute toxicity test，studying something about behavioral characteristics，weight，pathological anatomy of visceral organs，hematological indexes and biochemical indexes, the maximum amount of observation was 61.60 g/kg．There were no toxicity reactions shown during the observed period．There was no statistically significant difference(P>0.05). Conclusions:The toxicity of forsythia suspensa leavies is smaller. The data of the clinic practice can be provided to improve the safety. of dinical application.

mice；acute toxicity;forsythia suspensa leavies; extract

侯蘇方，女，助講，從事藥理學(xué)教學(xué)與研究工作

R965.3

A

1671-0126(2016)05-0001-04