等溫擴增熒光法（IAFT）快速檢測食品中沙門菌方法的建立

□ 王 耕 張 薇 陳安東 王振超 北京晟泰勃科技有限公司

等溫擴增熒光法（IAFT）快速檢測食品中沙門菌方法的建立

□ 王 耕 張 薇 陳安東 王振超 北京晟泰勃科技有限公司

沙門菌屬一類革蘭氏陰性桿菌，是引起人類食物中毒的常見細菌之一。傳統(tǒng)的沙門菌檢測方法主要是經過增菌培養(yǎng)，分離瓊脂平板培養(yǎng)等步驟后，通過形態(tài)學和染色法和各種生化指標，如硫化氫氣體、賴氨酸脫羧酶、氧化酶、靛基質尿素和KCN等加以鑒定。

等溫擴增熒光技術（Isothermal Amplification Fluorescent Method，IAFT）是核酸體外擴增和熒光法技術的結合，在恒溫條件下進行，通過添加特殊的DNA聚合酶和特異性引物，在擴增的同時加入熒光基團，通過熒光信號累積實時監(jiān)控擴增過程，實現(xiàn)核酸快速擴增和檢測，并對產物做溶解曲線分析。作為一種全新的快速鑒定方法，該方法所需實驗條件簡單、前處理要求低、特異性強、擴增速度快，可廣泛用于食源性微生物快速鑒定領域。

本研究應用新型核酸等溫擴增技術建立食品中沙門菌的快速檢測方法，針對其特異性核酸保守序列fimY基因進行擴增和檢測，總計使用了16株多種細菌的菌株，其中8株為沙門菌，結果表明，除8株沙門菌有陽性擴增曲線外，其余菌株均無擴增，該方法具有高度特異性。

實驗儀器及材料

材料

沙門菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、阪崎腸桿菌菌液；引物（6條）；IMM，optigene Limited公司；細菌基因組核酸提取試劑盒（STP）。

儀器

genie Ⅱ。

實驗步驟

引物稀釋

將引物稀釋成以下濃度，F(xiàn)IP/BIP：40 pmol/μL；F3/B3：5 pmol/μL；LF/LP：20 pmol/μL。

反應體系

IMM 15 μL；引物6 μL；樣本4 μL。

反應程序設定

65 ℃反應40 min。溶解曲線98～80 ℃，0.05℃收集一次熒光信號。

樣本制備

1 核酸提取試劑盒

按照試劑盒說明進行操作。

2 加熱煮沸法

取菌液1 mL離心10 min，棄上清后加入去離子水，100 ℃加熱10 min，置于冰上備用。

實驗結果

實驗結果顯示，在16株不同的菌株中，只有8株沙門菌對應的樣品中出現(xiàn)了S型擴增曲線，其他菌株和陰性對照均未出現(xiàn)擴增，結果特異，如圖1所示。

用加熱煮沸法提取核酸后擴增結果，曲線平滑度和擴增時間均比使用試劑盒提取的稍差，但特異性一致，如圖2所示。

圖1 擴增曲線

圖2 煮沸法擴增曲線

討論

本研究使用等溫擴增熒光法（IAFT）為基礎建立了沙門菌的檢測體系，與傳統(tǒng)方法比較，其結果符合率達到100%。從上述實驗結果中可看出，樣本僅需一步增菌即可上機進行檢測，除可使用試劑盒提取純度較高的核酸樣本進行擴增和檢測外，煮沸法抽提同樣適用，且準確率與傳統(tǒng)方法一致，實現(xiàn)了未知樣本的核酸現(xiàn)場快速檢測。

結論

集成核酸等溫擴增核心技術，以等溫擴增熒光快速檢測技術為基礎建立了沙門菌IAFT快速檢測技術體系。同時使用兩種核酸提取方法進行驗證，證明其不但可在實驗室進行實驗，野外現(xiàn)場同樣適用，不依賴實驗室儀器。

經與傳統(tǒng)方法以及PCR法進行比價和評價，其準確率與傳統(tǒng)培養(yǎng)法完全一致，且更為特異、敏感、精確、快速和便捷，適合于任何條件下的現(xiàn)場快速檢測，對于突發(fā)食物中毒等事件可起到第一時間準確診斷的作用，不僅適用沙門菌，其他常見的致病食源性微生物同樣可用，可為食品安全的質控和監(jiān)管提供必要的技術支撐，應用前景廣闊。