微流控芯片技術在公共衛(wèi)生監(jiān)測中的應用

蔣西然，章燕，秦紅梅，馮智田，于寧，李文利，覃開蓉

1.大連理工大學 a.生物醫(yī)學工程系；b.生命與醫(yī)藥學院，遼寧 大連 116024；2.遼寧省衛(wèi)生計生委衛(wèi)生計生監(jiān)督局，遼寧 沈陽 110005；3.遼寧中醫(yī)藥大學第一臨床學院，遼寧 沈陽 110032

專欄——公共衛(wèi)生與人體健康信息監(jiān)測-Part I

微流控芯片技術在公共衛(wèi)生監(jiān)測中的應用

蔣西然1a，章燕2，秦紅梅2，馮智田2，于寧3，李文利1b，覃開蓉1a

1.大連理工大學 a.生物醫(yī)學工程系；b.生命與醫(yī)藥學院，遼寧 大連 116024；2.遼寧省衛(wèi)生計生委衛(wèi)生計生監(jiān)督局，遼寧 沈陽 110005；3.遼寧中醫(yī)藥大學第一臨床學院，遼寧 沈陽 110032

編者按：隨著經(jīng)濟的飛速發(fā)展，掠奪性資源開發(fā)造成的空氣污染、土壤污染、水污染、沙漠化和生態(tài)失衡等問題，已直接威脅著人類自身的健康。對公共環(huán)境衛(wèi)生和自身健康信息的監(jiān)測是預防重大疾病、保障和促進人體健康的重要手段。在本專欄Part I系列文章中，主要介紹微流控芯片技術在公共衛(wèi)生監(jiān)測中的應用、基于肱動脈的中心動脈壓力波無創(chuàng)檢測儀研制、射頻微功率雷達在智能睡眠管理中的應用、以及基于紋理特征的肝硬化MRI分期等，為公共環(huán)境衛(wèi)生和人體健康信息監(jiān)測提供一定的方法。

欄目主編：覃開蓉

覃開蓉，大連理工大學電信學部生物醫(yī)學工程系教授，博士生導師。1991年獲復旦大學學士學位，1996年獲復旦大學博士學位，畢業(yè)后留校任教，先后任復旦大學講師和副教授。2002～2004年在東京大學從事博士后研究。2005～2007年任上海交通大學力學生物學與醫(yī)學工程研究所副教授。2007～2010年任新加坡國立大學電氣與計算機工程系研究員?，F(xiàn)為大連理工大學電子信息與電氣工程學部生物醫(yī)學工程系主任、中國自動化學會生物控制論與醫(yī)學工程專業(yè)委員會委員、遼寧省醫(yī)學信息與健康工程學會理事。近年來主要致力于力學、信息學與生物醫(yī)學交叉融合的定量研究。主持或參加國家自然科學基金委、科技部、教育部項目10余項；在本領域的國內外主流期刊上發(fā)表論文70余篇；獲省部級科技獎勵2項；申報國家發(fā)明專利10余項。

微流控芯片具有微型化、集成化、自動化、靈敏度高和成本低廉的優(yōu)勢，適合于便攜式現(xiàn)場檢測的應用。與傳統(tǒng)檢測方法相比，微流控技術能夠使檢測時間從數(shù)天降低至數(shù)小時甚至數(shù)分鐘，同時往往具有更高的靈敏度，特別有利于公共衛(wèi)生執(zhí)法人員在現(xiàn)場快速得到檢測結果。因此，該技術有望成為新一代公共衛(wèi)生監(jiān)測領域的新的技術制高點，在國外已經(jīng)有了很多應用，而在我國的發(fā)展水平仍較低。本文綜合國內外發(fā)展現(xiàn)狀，結合作者對該技術的研究經(jīng)驗，提出微流控芯片技術在我國公共衛(wèi)生領域的研究現(xiàn)狀、發(fā)展趨勢和應用前景。

微流控芯片；公共衛(wèi)生監(jiān)測；現(xiàn)場快檢

在我國的公共衛(wèi)生監(jiān)測工作中，目前面臨的一個難題是，執(zhí)法人員在現(xiàn)場采集樣品后，依據(jù)現(xiàn)有的技術無法快速得出結果，往往需要送到省會城市的實驗室進行分析測試，不但需要耗時數(shù)天乃至數(shù)周，而且價格昂貴，不利于衛(wèi)生執(zhí)法工作的現(xiàn)場開展。因此亟需一種具有便攜、快速和低成本特性的檢測技術，能夠在現(xiàn)場得出結果。微流控芯片正是一種能夠將傳統(tǒng)檢測技術微縮化的平臺，這些芯片的體積往往只有數(shù)平方厘米，重量約數(shù)十克，特別便于攜帶，而且對樣本和試劑的需求量極低，因此在公共衛(wèi)生領域的應用前景十分廣闊。

1 微流控芯片技術

微流控芯片技術，或稱芯片實驗室（Lab on A Chip）和微機電技術（Micro Electro Mechanical System，MEMS），興起于20世紀末期，并于21世紀初最早由方肇倫院士引入我國。微流控芯片技術集成了生物學、化學、醫(yī)學、微機電和微加工技術，通過在聚二甲基硅氧烷（PDMS）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、單晶硅和玻璃等材料上構建精密尺寸的微管道、閥門和腔室，由于芯片內部管道和腔室的尺寸通常在微米甚至納米尺度，因此反應所需的樣本量和試劑消耗量都極低（比常規(guī)檢測方法降低數(shù)倍至數(shù)百倍），適合于對稀少樣本的檢測[1]。例如Fang等[2]構建的快速核酸分析芯片，能夠在2 μL的反應體系中對樣本進行快速擴增，試劑和樣本的消耗量比常規(guī)方法降低了十倍。此外，微小體系中的流體具有很多新的特性，例如芯片內的化學反應速率往往比常規(guī)反應高一至兩個數(shù)量級，很多常規(guī)方法需要數(shù)小時的反應，在芯片內部僅需數(shù)分鐘或數(shù)秒鐘[3]。Yuan等[4]構建的檢測腦脊液中金黃葡萄球菌的微流控芯片系統(tǒng)，從樣本處理到得出檢測結果的時間縮短到60 min，能夠在現(xiàn)場快速得出檢測結果。相比于常規(guī)技術，微流控芯片的優(yōu)勢主要有：① 體積小。微型化的反應單元所需的試劑和樣品消耗量很低，能夠極大地降低成本；同時，微小的芯片便于攜帶，有利于現(xiàn)場檢測的應用；② 集成化和自動化程度高。通過微加工技術，可以方便地在芯片內整合多個反應單元，從而有利于實現(xiàn)高通量并行檢測?？梢?，如果能夠將微流控芯片技術應用于公共衛(wèi)生事業(yè)，就可以提高現(xiàn)場執(zhí)法的效率，給予現(xiàn)場執(zhí)法人員更高的自由度，同時，設備成本的大幅降低將使我國公共衛(wèi)生工作的監(jiān)測范圍更廣，利于實現(xiàn)在全國不同經(jīng)濟發(fā)展程度地區(qū)的大范圍普及。

微流控芯片技術可以運用于諸多領域，不但能優(yōu)化傳統(tǒng)的分析檢測技術，更體現(xiàn)了自身的獨特潛力和巨大優(yōu)勢。但是該技術在我國的起步較晚，目前，基于該技術開發(fā)的微型便攜式設備在醫(yī)學診斷、衛(wèi)生檢測和環(huán)境監(jiān)測等領域都剛剛嶄露頭角。

2 微流控芯片技術在空氣傳播性疾病快檢中的應用

空氣傳播疾病具有傳播速度快、范圍廣和難于監(jiān)測的特點，一旦擴散很容易造成大范圍污染，導致公眾恐慌[5]。例如2003年爆發(fā)的非典及近年的禽流感疫情，都因為缺乏有效的快速檢測手段，而無法對空氣病原菌的傳播方位進行及時快速的監(jiān)控。傳統(tǒng)的空氣微生物檢測技術主要有落板培養(yǎng)法和安德森采樣器法，原理均是將空氣中的微生物收集在平板培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，再通過顯微鏡鏡檢進行分析[6]。這些傳統(tǒng)方法的嚴重缺陷是：① 自然界絕大多數(shù)微生物尚無法培養(yǎng)，可培養(yǎng)的微生物只占總數(shù)的不到1%[7]，因此可檢測出的微生物種類極為有限；② 即便能夠培養(yǎng)生長，從空氣樣本采集到得出檢測報告，也往往需要數(shù)天到一周的時間，無法滿足實時快速的檢測需要。正因為此，對空氣傳播疾病的監(jiān)測和早期預防始終是一個世界性難題，同時也是我國空氣衛(wèi)生監(jiān)測工作面臨的重要挑戰(zhàn)。

本實驗室針對這一問題進行了深入研究，并構建了世界首個能夠快速捕獲、富集和檢測空氣中的病原微生物的微流控芯片系統(tǒng)。該系統(tǒng)含有一種特殊的魚骨狀結構，當空氣在這種結構的上方流過時，空氣中的微生物能被截留下來并保存在芯片的管道內。而后，利用微小體系的洗脫液對捕獲到的微生物進行洗脫富集，就可以很方便地得到高濃度的空氣微生物富集液，以便進行下游分子生物學分析。2012年，本實驗室構建了含有芯片PCR快速擴增模塊的分析系統(tǒng)，并以空氣氣溶膠中的大腸桿菌、金黃葡萄球菌和肺炎克萊伯桿菌等為檢測對象，對系統(tǒng)進行了可靠性驗證。該芯片可以在3個小時內實現(xiàn)從空氣微生物的采集到PCR擴增完成，所需試劑消耗僅為傳統(tǒng)方法的十分之一。整個系統(tǒng)可由電池供電，體積很小攜帶，適合于在野外或公共場所進行針對空氣病原微生物的快速檢測[1]。自2003年SARS疫情之后，人們對呼吸道病原體的快速篩查鑒定技術提出了更高的要求。已知的呼吸道病原體已超過二十余種，利用傳統(tǒng)的PCR技術只能對病原體樣本進行逐一擴增，費時費力，顯然無法滿足疫情控制和突發(fā)公共衛(wèi)生事件應急處置的需要。為了解決這個問題，筆者于2013年分別構建了含有高通量微柱式酶聯(lián)免疫測定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）模塊[8]和高通量恒溫核酸擴增（Loopmediated Isothermal Amplification of DNA，LAMP）模塊[4]的分析系統(tǒng)，其原理是巧妙地在微流控芯片內部設計了大規(guī)模并行式微反應單元，可以實現(xiàn)在一次實驗中，針對同一樣本進行多種不同指標的并行式檢測反應。2014年，通過進一步使用這種微流控芯片系統(tǒng)在山東省省立醫(yī)院對人流量密集的門診大廳、急診病房和公共走廊等地進行了空氣中金黃色葡萄球菌的檢測分析，這是世界上首次進行此類研究。該研究成果尚未發(fā)表，但此項研究成果為公共場所空氣病原微生物的快速檢測提供了一種全新的技術平臺，利用這種微流控芯片技術，有望構建對空氣氣溶膠所含多種傳染性病原微生物進行高通量、全自動的在線實時監(jiān)測的分析系統(tǒng)。

3 微流控芯片技術在微生物現(xiàn)場快檢中的應用

在人群密集的公共場所，很多傳染性疾病具有較強的隱蔽性，危害較大。對于我國公共衛(wèi)生監(jiān)測部門來說，能夠快速檢測出這些病原微生物，并向公眾提出流行性疾病的預警信息，是極為重要的一項工作內容。但是，受限到傳統(tǒng)檢測技術的限制，目前尚缺乏對公共場所病原微生物的快速檢測方法，監(jiān)測結果缺乏時效性。尤其是在偏遠地區(qū)，此類快速檢測更是難以開展。為了解決這個問題，當前的一個研究方向是將微流控芯片技術與LAMP技術相結合。LAMP技術是一種在恒溫條件下進行核酸分子擴增的新技術，具有較高的靈敏度，而且所得到的結果肉眼可見。在微流控芯片內部進行微小體系的LAMP核酸擴增反應，不但對樣品的需求量極低（通常為微升或納升），而且往往可以在一個小時內完成從樣品的采集到檢測結果的得出，速度快、消耗低，可以滿足現(xiàn)場快速檢測的需要[4]。例如復旦大學方雪恩博士構建的一種數(shù)平方厘米大小的微反應芯片，可以同時對3種不同亞型的大腸桿菌進行快速檢測，這些芯片造價低廉，便于攜帶，而且無需復雜的設備讀取結果[9]。本實驗室前期開發(fā)的一種能夠快速檢測病原微生物的芯片設備，能夠對醫(yī)院等公共場所采集的樣本進行快速分析，從采樣到得出檢測結果總耗時約1 h，同時，芯片反應體系只需約1.5 μL的試劑消耗量，而芯片本身的造價也僅為十余元，在成本上具有很大優(yōu)勢。該系統(tǒng)在針對標準菌株和臨床樣本的檢測實驗中，均獲得了特異性較高的結果，穩(wěn)定性較好[4]。這種便攜性強、操作簡單而且結果肉眼可見的微流控芯片，對于偏遠山區(qū)或災區(qū)的現(xiàn)場衛(wèi)生監(jiān)測，以及戰(zhàn)場或生物反恐所需的快速檢測，都有重要的應用價值。

另外，微流控芯片具有易于跟其它技術相整合的特性，例如Stedtfeld等[10]將微流控檢測芯片與智能手機聯(lián)用，能夠將芯片上獲得的光學信號輸入手機，并利用手機軟件進行運算分析，這就特別適合于衛(wèi)生執(zhí)法人員在現(xiàn)場快速檢測，也有利于實現(xiàn)公眾直接參與公共衛(wèi)生監(jiān)察，有利于提高公民衛(wèi)生意識。而Lilehoj等[11]在此基礎上進一步開發(fā)的芯片系統(tǒng)，是通過特異性抗體實現(xiàn)對瘧原蟲的特異性識別和捕獲，并將產(chǎn)生的微弱的電信號傳導至手機中，再利用手機的智能軟件進行深入分析處理。Navruz等[12]則將微流控芯片與智能手機的攝像頭相連接，構建了便攜型顯微呈象系統(tǒng)，能夠對物體表面的病原微生物進行實時呈象分析。這些最新的研究進展，都是利用微流控芯片的便攜性，針對現(xiàn)場實時檢測的嘗試。值得一提的是，近年在我國興起的“健康云”的概念，也是利用手機等便攜式終端將現(xiàn)場數(shù)據(jù)通過網(wǎng)絡上傳的中心實驗室服務器，并在實驗室得出更精密的檢測結論后再發(fā)送給用戶，這種云網(wǎng)絡的基礎依賴于一種微型且快速高效的生物醫(yī)學檢測端，而微流控芯片技術恰好可以滿足這種需求，不但可以替代昂貴的儀器設備，而且具有更高的檢測靈敏度，更有利于簡化繁瑣的操作步驟。在公共衛(wèi)生監(jiān)測領域，如果也能建立起類似的云系統(tǒng)，就便于一線執(zhí)法人員快速得到檢測結果，從而促進衛(wèi)生監(jiān)察工作的快速和科學開展。

4 微流控芯片技術在水體微生物監(jiān)測中的應用

水是病原微生物傳播的主要媒介之一，世界各地由于病原生物污染水源而引發(fā)的大規(guī)模疾病暴發(fā)事件屢見不鮮，而發(fā)展中國家更是有數(shù)億人的生活用水得不到安全保障。水質監(jiān)管部門除了要對水中有毒有害化合物和重金屬進行監(jiān)測外，還要兼顧對水中病原微生物的檢測。而在水體微生物檢測中，受限于已有的檢測分析技術，往往需要將樣品采集、病原體富集、病原體分離純化以及病原微生物鑒定等工作分時分地完成，工作效率很低[13]。為此，世界多國政府將目光投向了微流控芯片技術。本實驗室前期構建的一種結構簡單的微流控芯片，能夠在20 min內檢測水體中的阿米巴蟲，所需樣本量僅為2 μL[14]。而通過在芯片內部整合生物免疫磁珠或電化學等技術，則可以高效完成對于水中一種或多種特定微生物的富集工作。例如Guan等[15]采用芯片免疫磁珠分離法對水中大腸桿菌富集率可達92%～96%。而利用微流控芯片的特殊結構，則能夠在富集藍賈第鞭毛蟲卵囊和隱孢子蟲孢囊的同時，將它們按照尺寸大小的不同分選出來[16]。采用微流控技術完成富集工作的另一個優(yōu)勢在于，通過在芯片內整合檢測模塊，就可以將下游檢測所需的固定和染色等步驟全部整合到一塊芯片上完成，再通過配合使用便攜式光學檢測系統(tǒng)，就能方便地實現(xiàn)對樣品中寄生蟲卵的信息進行快速獲取，特別是對于寄生蟲孢囊或卵囊的檢測技術已經(jīng)較為成熟。富集到的細菌或病毒可以直接在芯片上完成從細胞裂解到核酸提取、擴增和產(chǎn)物鑒定等全部工作流程，從而在基因水平上完成對病原微生物的精確鑒定。

目前，基于微流控芯片開發(fā)的檢測設備對大腸桿菌和隱孢子蟲等病原微生物的檢測極限可以達到單個細胞的水平，這得益于在微流控芯片內部構建的微型單細胞捕獲和實時檢測模塊，并可以很方便地實現(xiàn)精確定量[17]。將微流控技術與光學系統(tǒng)和電子設備整合一體，以實現(xiàn)自動化分析也是當下一個重要的研究方向[18]。另外，對于前期水樣采集和預處理環(huán)節(jié)的技術革新與優(yōu)化同樣影響著微流控技術在水質監(jiān)測領域的發(fā)展。可以預見，基于微流控芯片的分析設備將極大降低水質監(jiān)測的成本，提高水檢部門的工作效率，提高偏遠地區(qū)的水體微生物監(jiān)測水平。

5 展望

微流控芯片技術興起的時間較短。但近年來該技術在發(fā)達國家已經(jīng)受到了極大的關注。尤其是2006年Nature雜志長篇幅詳細報道了微流控芯片的發(fā)展，并將其評價為“這一世紀的技術”[19]以后，微流控芯片逐漸成為了涵蓋生物、化學和醫(yī)學等諸多領域的新的技術制高點，但遺憾的是在我國的研究較少，距離實際應用還有很長的路要走。微流控芯片技術在我國公共衛(wèi)生監(jiān)測，尤其是現(xiàn)場快檢領域的應用前景十分廣闊，在不久的將來甚至有望引領一場微型醫(yī)學檢測技術的革命。

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Microfluidics and Its Application in Public Health Monitoring

JIANG Xi-ran1a, ZHANG Yan2, QIN Hong-mei2, FENG Zhi-tian2, YU Ning3, LI Wen-li1b, QIN Kai-rong1a
1. a. Department of Biomedical Engineering; b. School of Life Science and Medicine, Dalian University of Technology, Dalian Liaoning 116024, China; 2. Liaoning Health and Family Planning Inspection, Health and Family Planning Commission of Liaoning Province, Shenyang Liaoning 110005, China; 3. the First Clinical College, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang Liaoning 110032, China

Microfluidic technology provides advantages like miniaturization, integration and automation, as well as high sensitivity and low cost, which makes it suitable for point-of-care detections. Comparing with traditional methods, the detection time decreases from days to hours or minutes with lower detection of limit, making the technology helpful for the public health supervisors to obtain analytical results rapidly in field. Thus, the microfluidics is a great potential technique in public health inspection and has been widely used in modern countries, while rarely utilized in China. Herein, in combination of the author’s experience in research of the microfluidic technology, this paper reviewed its research progress, development trend and future applications in consideration of its current research status quo in China.

microfluidics; public health monitoring; point-of-care detection

R446

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2016.08.002

1674-1633(2016)08-0005-04

2016-07-25

國家自然科學基金項目（81501833）；遼寧省自然科學基金（2015020574）；上海市大氣顆粒物污染防治重點實驗室開放課題基金（FDLAP15003）。

本文作者：蔣西然，講師，博士，研究方向：微流控芯片技術。通訊作者：覃開蓉，教授。

作者郵箱：xrjiang@dlut.edu.cn

郵箱：krqin@dlut.edu.cn